植入前遺傳學診斷及篩查技術臨床應用譚躍球tanyueqiu@南大學生殖與干細胞工程研究所*人類干細胞國家工程研究中心*中信湘雅生殖與遺傳專科醫院目前一頁\總數八十二頁\編于十二點內容概要植入前遺傳學診斷與篩查的概念PGD檢測流程染色體易位攜帶者的PGD基于全染色體篩查的PGD(PGD-CCS)單基因病PGD背景介紹適應征及技術進展臨床應用植入前診斷植入前遺傳學診斷和篩查的概念植入前遺傳學診斷的臨床應用植入前遺傳學篩查的臨床應用目前二頁\總數八十二頁\編于十二點一、植入前遺傳學診斷與篩查的概念PGD(PreimplantationGeneticDiagnosis)：又稱為孕前診斷(preconceptiongeneticdiagnosis,PGD)。指在胚胎植入前，利用DNA分析技術對顯微活檢的胚胎細胞進行染色體異常或遺傳性疾病進行診斷，選擇正常的胚胎植入。第一部分植入前遺傳學診斷和篩查的概念目前三頁\總數八十二頁\編于十二點第三代試管嬰兒？PGD/PGS是以ICSI-ET為基礎，結合顯微操作技術和分子生物學研究的而發展起來的。目前四頁\總數八十二頁\編于十二點PGD的意義PGD可在孕前階段杜絕X-連鎖隱性遺傳病、染色體病和基因病患兒的妊娠，避免人工流產終止異常妊娠給廣大婦女的身心痛苦。理論上還可減少遺傳病在人群中的遺傳負荷。PGD是遺傳性病防治的重要手段，是Edwards獲諾貝爾獎的理由之一。植入前診斷傳統的產前診斷目前五頁\總數八十二頁\編于十二點PGD發展歷程最早于1965由Edwards提出。1968年Gardncr和Edwards在顯微操縱下對兔囊胚進行活檢，取出少量滋養外胚層細胞分析染色質來選擇雌性胚胎。1990年Handyside報道了世界第一例植入前性別診斷嬰兒的出生，開創了產前診斷的新紀元。1994年，Munne用FISH技術，在植入前診斷胚胎染色體非整倍體及性別獲得成功。1999年，Terlin等用巢式PCR和單鏈多態性分析技術，對單細胞進行視網膜母細胞瘤的易感性分析，在植入前確定胚胎未來發生腫瘤的可能性大小，從而為PGD應用于人類胚胎基因表達的研究開辟了嶄新的途徑。2001年Verlinsky有報道對胚胎進行HLA選型以便于骨髓移植。進一步拓寬了該技術的研究和應用。目前六頁\總數八十二頁\編于十二點染色體異常（羅氏易位、相互易位、倒位等）染色體異常的篩查單基因病（一般的單基因病、性連鎖遺傳病等）單基因異常的篩查

PGD期望解決的問題目前七頁\總數八十二頁\編于十二點

植入前遺傳學篩查的概念胚胎植入前遺傳學篩查（PreimplantationGeneticScreening,PGS），是指胚胎植入著床之前，對早期胚胎進行染色體數目和結構異常的檢測，通過一次性檢測胚胎23對染色體的結構和數目，挑選正常的胚胎植入子宮，以期獲得正常的妊娠，提高患者的臨床妊娠率，降低多胎妊娠。PGS目前特指針對染色體數目異常，即非整倍體；PGS理論上將來可以應用于單基因病。PGS是低風險人群，夫妻雙方的染色體或者基因是正常的。目前八頁\總數八十二頁\編于十二點二、PGD檢測流程卵子精子ICSI活檢取樣胚胎冷凍遺傳學檢測選擇胚胎胚胎植入遺傳咨詢知情談話FISHCHIPPCRMPSIVF臨床促排卵目前九頁\總數八十二頁\編于十二點極體活檢活檢第一極體和第二極體，檢測母源性的染色體結構異常或基因突變，以及減數分裂異常造成的染色體非整倍體。優點：對卵母細胞的發育沒有影響。

缺點：只能檢測母源性的染色體異常；

不能檢測受精后發生的染色體異常；

可檢測細胞數少，易發生檢測失敗。（一）活檢技術選擇目前十頁\總數八十二頁\編于十二點卵裂球活檢在D3胚胎發育到6-10細胞時活檢出1-2個卵裂球，進行遺傳學診斷。

優點：最成熟最常用的活檢方法。

缺點：活檢出卵裂球后降低了胚胎的發育潛能；

細胞數少，容易發生檢測失敗(細胞固定及

雜交失敗，擴增失敗，ADO等)。

目前十一頁\總數八十二頁\編于十二點囊胚活檢D5-6天胚胎發育到囊胚階段后，活檢囊胚滋養層細胞進行遺傳學檢測。

優點：對滋養層細胞的活檢不影響將要發育成胎

兒的內細胞團的發育；

可檢測細胞數較多，檢測失敗概率降低。

對SNP-array而言，能大大減低費用。

缺點：大部分情況下（除非可以在24小時之內出結果）

需將活檢后的囊胚冷凍保存。

目前十二頁\總數八十二頁\編于十二點染色體易位(Translocation):一種染色體結構異常，一條染色體的一段轉移到同一條或另一條染色體上，導致易位片段基因的重排

(Thompson&ThompsonGENETICSINMEDICINE2010)易位是一種常見的染色體結構重排異常，新生兒中發病率0.2%.(Sternetal.,1999)臨床上兩種類型的易位最常見：羅氏易位和相互易位一、染色體易位攜帶者的FISH-PGD第二部分植入前遺傳學診斷的臨床應用目前十三頁\總數八十二頁\編于十二點4q2520q12相互易位：兩條非同源染色體之間進行片段的交換，常常是整個末端的斷裂并互換。--Thompson&ThompsonGENETICSINMEDICINE2010著絲粒→←著絲粒Derivativechromosome4Derivativechromosome20目前十四頁\總數八十二頁\編于十二點羅氏易位：這種類型的易位是在兩組端著絲粒染色體(D組andG組,染色體13-15,21-22)間進行交換，往往在靠近著絲粒的區域斷裂重組，導致易位的兩條染色體隨體的丟失--Thompson&ThompsonGENETICSINMEDICINE2010Centromere→Centromere→Chr21Chr14der(14;21)目前十五頁\總數八十二頁\編于十二點易位攜帶者的健康風險平衡的染色體易位個體往往沒有明顯的疾病表型，稱為“易位攜帶者”。但卻多存在生殖的障礙；易位攜帶者主要的遺傳風險起源于配子減數分裂的過程，攜帶者可產生高比例的不平衡配子（精子和卵），可以導致流產，出生染色體異常患兒引起出生缺陷（特別是智力障礙），并可導致不孕和不育；目前十六頁\總數八十二頁\編于十二點平衡易位攜帶者的遺傳風險四射體對于相互易位攜帶者，配子分離模式理論上產生18種配子類型：包括1種正常,

1種平衡易位型

和16種不平衡分離的配子。目前十七頁\總數八十二頁\編于十二點normalbalanceddisomy21disomy21nullisomy21Nullisomy14羅氏易位產生6種配子類型，包括1中正常，1中平衡易位型，其余4種不平衡分離配子，這類不平衡配子往往導致流產。羅氏易位的遺傳風險目前十八頁\總數八十二頁\編于十二點染色體易位和生殖健康反復流產：

3-4%的反復流產患者存在染色體結構異常

相互易位占61%羅氏易位占16%--Cliffordetal.1994;Franssenetal.2005我院數據：共發現1425易位攜帶者，其中相互易位76.6%(1094/1428)，羅氏易位23.4%(334/1428).反復流產–

75.2%(1071/1425)嚴重男性因素–

17.2%

(245/1425)卵巢功能下降–1.2%

(18/1425)

目前十九頁\總數八十二頁\編于十二點PGD用于易位攜帶者治療的歷史產前診斷移植以來被有效的用來避免染色體異常患兒出現，但是診斷異常后流產給婦女帶來心理和生理的負擔，并可能導致生育障礙；第一例PGD的成功妊娠，利用Y染色體特異性DNA擴增技術成功對人胚胎性別進行診斷并獲得妊娠。--Handyside,AH.Nature,19901998年，FISH技術被用于易位攜帶者的PGD診斷并獲得成功

--ConnCMetal.1998;MunnéSetal.1998;PierceKEetal.1998

目前二十頁\總數八十二頁\編于十二點熒光原位雜交(FISH)熒光原位雜交技術（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）是以利用熒光標記的特定基因或染色體片段作為探針，與染色體特定序列DNA分子雜交，可以確定分裂細胞或間期細胞對應染色體序列的位置及數目，以此檢測染色體數目或結構異常。FISH技術有以下幾個特點：①安全、快速、靈敏度高；②探針能較長時間保存；③多色標記，簡單直觀；④可用于中期染色體及間期細胞的分析人類干細胞國家工程研究中心*中信湘雅生殖與遺傳專科醫院目前二十一頁\總數八十二頁\編于十二點熒光原位雜交(FISH-PGD)技術流程目前二十二頁\總數八十二頁\編于十二點歐洲生殖與胚胎學協會(ESHRE)

---FISH-PGD實踐指南目前二十三頁\總數八十二頁\編于十二點ESHRE要求：

實驗室胚胎活檢技術；遺傳室細胞核玻片固定基礎，并對固定程序有詳細要求；選擇合適的探針，對平衡易位患者需提前做好外周血淋巴細胞中期分裂相預實驗；歐洲生殖與胚胎學協會(ESHRE)

---FISH-PGD實踐指南目前二十四頁\總數八十二頁\編于十二點細胞核玻片固定程序：活檢卵裂球(1枚或2枚)或囊胚滋養層細胞(TE)；低滲液滴中處理≥5min；在圓圈標記對應的玻片正面部位加固定劑(Tween-20/HC1)，將低滲好的細胞轉至固定劑液滴中；待固定劑完全干燥后，可放在-20℃備用，或者直接進入下一步；60℃烤片，30min-3h；RNase消化，蠟膜封片，濕盒中37度孵育30min-1h；將RNase處理后的玻片依次過2xSSC、75%、90%、100%酒精，梯度脫水；將玻片放入變性液中，75℃預變性3-5min（目的是將DNA雙鏈打開）；玻片依次過75%、90%、100%酒精梯度脫水，2min/濃度，完全風干；探針75℃變性5min；將探針加到風干的玻片樣本上，雙層蠟膜封片，置于濕盒中，37℃過夜（雜交4-6h）；玻片依次過洗滌液WS1三缸(45℃)，WS2兩缸（室溫），WS3一缸（室溫）；75%、90%、100%酒精梯度脫水，風干；加入DAPI，處理3min后，直接熒光顯微鏡下觀察。歐洲生殖與胚胎學協會(ESHRE)

---FISH-PGD實踐指南目前二十五頁\總數八十二頁\編于十二點平衡易位探針選擇和淋巴細胞預實驗探針的選擇：商業探針的使用需通過QC質控；自制探針也需要進行合適的QC/QA鑒定。所有探針在應用到臨床檢測前都需經過細胞雜交預實驗，評估特異性、亮度及彌散度；對于所有平衡易位攜帶者，需要取用對應易位區段合適的探針以及探針組合對夫妻雙方淋巴細胞中期分裂相及間期核進行預實驗檢測：至少分析20個中期分裂相，確保探針位置在正確的染色體上，易位片段能被正確指示；至少分析100個間期核，評估特異性、亮度及彌散度。歐洲生殖與胚胎學協會(ESHRE)

---FISH-PGD實踐指南著絲粒探針位點特異性探針亞端粒探針目前二十六頁\總數八十二頁\編于十二點一例相互易位攜帶者PGD，核型為：46,XY,t(6;10)(q13;p15)，活檢2枚胚胎，對單卵裂球進行FISH檢測，發現1枚信號正常，移植1枚，妊娠單胎，產前診斷為正常核型，已出生正常嬰兒。FISH-PGD舉例：平衡易位攜帶者預實驗結果：外周血淋巴細胞培養制備的一個中期分裂相和一個間期核FISH探針：易位片段的亞端粒探針（6q13→6qter，Tel6qSpectrumOrange；10p15→10pter，Tel10pSpectrumGreen）和10號著絲粒片段的著絲粒探針（10p15→10qter,blueCEP10alphasatelliteSpectrumAqua）。目前二十七頁\總數八十二頁\編于十二點一例相互易位攜帶者PGD，核型為：46,XY,t(6;10)(q13;p15)，活檢2枚胚胎，對單卵裂球進行FISH檢測，發現1枚信號正常，移植1枚，妊娠單胎，產前診斷為正常核型，已出生正常嬰兒。FISH-PGD舉例：平衡易位攜帶者FISH-PGD檢測結果：不同通道濾光片下觀察到的細胞核中的FISH探針熒光信號。a胚胎細胞核中每個探針均為2個雜交信號提示每個探針位點均為2個拷貝，表示易位相關的染色體組成為正常或平衡易位。b胚胎核中均為1個紅色信號、3個綠色信號和2白色信號，分別提示6號易位片段為一個拷貝、10號易位片段為3個拷貝和10號著絲粒片段為2個拷貝，表示該胚胎為臨近-1分離形成的6q13→6qter單體和10p15→10pter三體不平衡產物。臨近-1分離模式圖目前二十八頁\總數八十二頁\編于十二點ReciprocaltranslocationcarriersRobertsoniantranslocationcarriersBiopsiedcycles257149Oocytenumber14.53±6.5313.81±6.83NumberofgoodqualityembryosonD37.12±4.186.85±4.61NumberofgoodblastocystsonD50.93±1.501.04±1.71Biopsiedembryo(median(range))10(1-30)9(1-24)Biopsied

embryos27091420Normal/balanced17.5%(475)31.8%(451)Unbalanced69.5%(1882)56.3%(799)Testingfailure13.0%(352)12.0%(170)Cancelledcycles(rate)82(31.9%)24(16.1%)2006-2011年我院易位攜帶者進行d3

FISH-PGD結果正常或平衡易位胚胎比例低，尤其是相互易位目前二十九頁\總數八十二頁\編于十二點ReciprocaltranslocationcarriersRobertsoniantranslocationcarriersBiopsiedcycles257149Oocytenumber14.53±6.5313.81±6.83NumberofgoodqualityembryosonD37.12±4.186.85±4.61NumberofgoodblastocystsonD50.93±1.501.04±1.71Transferredembryo(median(range))2(1-3)2(1-3)Cyclesacceptedtransfer175125Clinicalpregnancyrateperbiopsiedcycle33.5%(68/257)32.2%(48/149)ClinicalpregnancyrateperET38.9%(68/175)38.4%(48/125)Implantationrate32.2%(86/267)28.1%(62/221)Miscarriagerate16.2%(11/68)16.7%(8/48)Live

birth

rateperBiopsy22.2%(57/257)26.8%(40/149)Healthbabies/deliveredbabies52/5235/352006-2011年我院易位攜帶者進行d3

FISH-PGD結果目前三十頁\總數八十二頁\編于十二點單卵裂球FISH幾種風險可能導致沒有準確結果：雜交背景干擾太強的情況雜交雜質信號干擾的情況雜交失敗未見信號的情況固定或重雜交細胞核丟失的情況囊胚FISH相對卵裂期FISH更有優勢？1.活檢細胞數的增多有利于信號的判定；2.直觀方便檢出胚胎嵌合體。目前三十一頁\總數八十二頁\編于十二點胚胎序號Tel7p信號數Tel8q信號數CEP8結果提示11[6]3[6]2[6]異常21[7]3[7]2[7]異常31[5]3[5]2[5]異常42[7]2[7]2[7]正常或平衡易位51[4]3[4]2[4]異常62[7]2[7]2[7]正常或平衡易位71[7]3[7]2[7]異常81[4]3[4]2[]異常91[6]3[6]2[6]異常102[4]3[2]2[4]2[2]2[4]2[2]異常113[2]1[2]2[2]異常囊胚FISH-PGD舉例：平衡易位目前三十二頁\總數八十二頁\編于十二點FISH面臨的挑戰目前三十三頁\總數八十二頁\編于十二點不同實驗室FISH檢出率和準確率波動較大著床率和妊娠率隨著FISH檢測錯誤率的上升而降低目前三十四頁\總數八十二頁\編于十二點FISH技術局限FISH技術僅能檢測有限的染色體，因此患者經FISH-PGD成功妊娠，但仍不可避免因其它未檢測的非整倍體異常妊娠而引發的早期流產或出生缺陷。FISH-PGD早期流產胚胎進行比較基因組雜交檢測，檢出5號染色體重復。需要全染色體篩查為基礎的PGD技術？目前三十五頁\總數八十二頁\編于十二點二、基于全染色體篩查的PGD(PGD-CCS)PGDwithComperhansiveChromosomeScreening，避免了FISH僅能檢測少數染色體的限制，采用全染色體篩查的方式對易位或倒位攜帶者進行PGD診斷，同時排除其它染色體非整倍體異常。目前三十六頁\總數八十二頁\編于十二點易位攜帶者的SNP-PGD臨床情況總結1.囊胚+SNP活檢分析增加PGD診斷的準確性2.基于SNP的PGD-CCS可以檢測出除易位染色體外其他染色體的異常，減少流產目前三十七頁\總數八十二頁\編于十二點易位攜帶者SNP-PGD的臨床結局總結目前三十八頁\總數八十二頁\編于十二點共分析360個患者年齡在20~44歲之間，平均新發生異常的幾率是27.2%

Age是否SNP-PGD需要用于每個易位攜帶者?目前三十九頁\總數八十二頁\編于十二點ReciprocaltranslocationcarriersRobertsoniantranslocationcarriersD5-FISHSNParrayD3-FISHD5-FISHSNParrayD3-FISHTransfercycles29771751238125ClinicalpregnancyrateperET55.2%(16/29)63.7%(49/77)38.9%(68/175)83.3%(10/12)63.2%(24/38)38.4%(48/125)Implantationrate40%(16/40)59.5%(49/97)32.2%(86/267)59.1%(10/17)54.9%(28/51)28.1%(62/221)Miscarriagerate25.0%(4/16)8.16%(4/49)16.2%(11/68)0(0/10)12.5%(3/24)16.7%(8/48)ComparisonD5-FISHandd5-SNPresultsintranslocationcarriers<35yrs對于年輕的羅氏易位攜帶者，d5FISH能獲得d5SNP相似的臨床妊娠結局目前四十頁\總數八十二頁\編于十二點新一代測序技術(NGS)正逐步興起婚前孕前植入前產前新生孕期指導新夫婦家庭計劃指導低成本同時檢測>40種代謝疾病，可覆蓋大規模人群建立國家和地區發病率數據庫

確認診斷疾病，特別是稀有疾病疾病亞型分類，或鑒別相似表型的不同疾病，進行有效干預

拯救嬰兒生命，使他們更健康減少對社會和家庭帶來的負擔減少出生缺陷指導意義NextGenerationSequencing(NGS)目前四十一頁\總數八十二頁\編于十二點NGS-PGD/PGS技術路線WGASNParray檢測NGS檢測平行實驗已知樣本非整倍體單個胚胎干細胞正常核型淋巴細胞FISH-PGD診斷為異常的胚胎重活檢淋巴細胞全基因組擴增獲得產物臨床并行實驗SNParray檢測NGS檢測建立平臺評估檢出率，準確度等指標，芯片與測序相當目前四十二頁\總數八十二頁\編于十二點方法學的建立2X測序深度能覆蓋60%人類基因組，10X深度能覆蓋>90%人類基因組。等位基因脫扣ADO率約5-20%；平均值為4%，近著絲粒區段發生ADO率相對較高。堿基對檢出誤差：C:G>T:A.Before&afterGCbias

correction專為單細胞測序CNV分析而設置的算法，矯正WGA產生的GC偏差，使結果更接近基因組DNA測序水平。

目前四十三頁\總數八十二頁\編于十二點NGSvsSNParray在非整倍體與16M缺失重復的比較方法學的建立目前四十四頁\總數八十二頁\編于十二點技術特點高通量，高準確度：使用新一代測序技術，克服PCR技術通量低的缺點。不容易產生漏檢：可對所有23對染色體進行檢測。FISH技術由于每一輪雜交的探針數目是有限的，無法對所有23對染色體進行檢測，容易產生漏檢。自動化程度高：測序數據通過SOAP比對，SegSeq軟件進行分析目前四十五頁\總數八十二頁\編于十二點我們前期已建立了FISH、SNP芯片技術檢測染色體異常，并與華大合作建立了單細胞水平的全基因組測序。2012年8月誕生了世界首例由NGS-PGD助孕的健康女嬰。我中心完成的NGS-PGD/PGS工作目前四十六頁\總數八十二頁\編于十二點三、單基因病PGD目前四十七頁\總數八十二頁\編于十二點ESHREPGD工作組對擴增基礎的PGD的

最佳實踐指南

目前四十八頁\總數八十二頁\編于十二點單基因病PGD的流程1.預備實驗1.1基因診斷1.2設計個性化方案1.3構建單體型1.4基因組水平實驗1.5淋巴細胞/廢棄胚胎細胞水平實驗2.臨床實驗2.1臨床前預備實驗2.2臨床診斷3.產前診斷目前四十九頁\總數八十二頁\編于十二點1、等位基因脫扣（alleledropout,ADO）

影響PGD準確性的主要因素之一，其發生率約為5-20%。可導致胚胎的誤診。導致ADO的原因目前仍未充分弄清。

解決辦法：

①采用多重PCR的方法，加入標記位點的檢測；

②控制擴增片段大小(<350bp)以及合適的引物設計；

③采用熒光PCR；

④提高變性溫度至96℃，選用合適的聚合酶；

⑤增加活檢細胞數等。

單基因病PGD中，著重解決等位基因脫扣和污染兩大問題目前五十頁\總數八十二頁\編于十二點2、污染導致PGD診斷失敗和誤診的另一重要因素。污染主要來自透明帶上殘留的精細胞和母源的丘細胞以及前次試驗擴增的DNA殘留物我們的解決辦法：1）采用ICSI防止精細胞污染；2）防止丘細胞污染：A.操作中盡量去除卵細胞周圍的丘細胞。B.活檢的卵裂球在無污染的PBS或培養基中反復洗脫。C.采用多重PCR同時檢測活檢標本及雙親的DNA指紋加以鑒別。3)防止外源DNA污染A.實驗室物理分區；所有的試劑分裝，不反復凍融，耗材一次性使用。B.設立空白對照。C.在專用層流室中操作（如右圖）。目前五十一頁\總數八十二頁\編于十二點育齡夫婦未采用任何避孕措施，1年或1年以上未能受孕，稱為不孕癥；雖有過妊娠，但均已流產或死胎，而未能獲得活嬰者，稱為不育癥。中國不孕不育人數大約5000萬,不孕不育的發生率12％~15％我們的研究發現，人類早期自然流產胚胎中超過50%發生了非整倍體異常。植入前遺傳學篩查背景----不孕癥和不育癥世界范圍內不孕不育率高達15%，成為繼癌癥和心腦血管疾病之外，嚴重影響人類健康的第三大疾病。正常（例）重復（例）缺失（例）復雜異常（例）異常率（%）早孕期流產7526521393851.7中、晚孕期流產106173015.9總數16836691423850.4TanYQ,etal.Geneticchangesinhumanfetusesfromspontaneousabortionafterinvitrofertilizationdetectedbycomparativegenomichybridization.BiolReprod.2004Feb;70(2):495-9.Epub2003Oct15.第三部分植入前遺傳學篩查的臨床應用目前五十二頁\總數八十二頁\編于十二點NewEnglandJournalofMedicine351(19):1927-1929，2004植入前遺傳學篩查背景----年齡與生育關系文獻統計隨著女性年齡的升高，流產率逐漸升高，生育率急劇下降。我中心2012年-2013年間不同年齡階段的296對夫婦共1016枚檢測胚胎異常率統計，新發生染色體異常率隨女方年齡的增長而升高。目前五十三頁\總數八十二頁\編于十二點植入前遺傳學篩查背景--染色體異常與胚胎發育染色體異常是引起胚胎發育能力降低的重要原因，也是出生缺陷的重要原因。據報道，體外培養的D3分裂期卵裂球有50%-70%概率出現染色體異常，其出現頻率隨母方年齡增加而增加。即使發育到D5囊胚期，仍有40%概率出現染色體異常。傳統的胚胎形態學評價體系不能反映胚胎的遺傳學真實情況。據報道，在形態學良好的胚胎中，僅42%的胚胎是染色體完全正常的。目前五十四頁\總數八十二頁\編于十二點植入前遺傳學篩查的概念PGS(Preimplantation

Genetic

Screening)指對在胚胎發育中散在發生的染色體非整倍體異常進行篩查，以幫助篩選染色體水平上最佳胚胎，理論上可以提高試管嬰兒的著床率和活產率。PGS適應征：針對高齡女性、反復植入失敗者，曾有染色體異常兒妊娠史、反復自然流產、嚴重男性因素不育等早期PGS應用的技術：熒光原位雜交(FISH)JoyceHarper,etal2011目前五十五頁\總數八十二頁\編于十二點FISH技術的改進增加FISH探針的顏色以及數量(為了易于區分避免色差，至多可選擇5色同時雜交)。增加雜交次數：對細胞核信號洗脫后重復雜交(一個細胞核最多可承受三次洗脫重雜交)進行雙卵裂球活檢？目前五十六頁\總數八十二頁\編于十二點代表性文章1994

Grif?nDK,etal.Clinicalexperiencewithpreimplantationdiagnosis

ofsexbydual?uorescentinsituhybridisation.JAssReprodGenet

11,132–143.(首次使用雙重雜交)2006

WeierJF,etal..Molecularcytogeneticstudiestowardsthefullkaryotypeanalysisofhumanblastocystsandcytotrophoblasts.CytogenetGenomeRes.2006;114(3-4):302-11(對24色FISH的嘗試)2009

CollsP,etal.Increasedefficiencyofpreimplantationgeneticdiagnosisforaneuploidybytesting12chromosomes.ReprodBiomedOnline,19(4):532-538.(首次用到FISH-PGD檢測12條染色體)目前五十七頁\總數八十二頁\編于十二點以FISH技術和第三天活檢為基礎的PGS

----并未顯示能提高分娩率卵裂期使用FISH技術的隨機對照試驗檢測了不同數目的染色體：Staessenetal,2008Meyeretal,2009Mersereauetal,2008Blockeeletal,2008Debrocketal,2010Hardarsonetal,2008Schoolcraftetal,2009…………沒有一個實驗顯示能增加分娩率，甚至部分研究顯示分娩率顯著下降。目前五十八頁\總數八十二頁\編于十二點目前五十九頁\總數八十二頁\編于十二點1.僅能檢測少數染色體(至多12條)；2.商業檢測探針多位于染色體亞端粒區(長短臂末端)，不能定位染色體斷裂位點；3.信號強度易受到固定效果、探針靈敏度、背景干擾以及雜交程度等的影響；文獻報道FISH誤診率約7~10%。可能的原因？分裂期卵裂球高度的染色體異常嵌合，導致檢測細胞不能很好代表整個胚胎；卵裂期活檢過程本身可能對胚胎發育潛能產生危害和負面影響選擇合適的活檢時間全染色體篩查的方法更多RCTs研究更為有效的PGS技術目前六十頁\總數八十二頁\編于十二點卵裂期活檢

-損傷胚胎發育潛能的風險--

Tan

YQ.,etal.HumRerpod.2013;28(9):2581-2592D3活檢影響囊胚發育目前六十一頁\總數八十二頁\編于十二點卵裂期活檢

-損傷胚胎發育潛能的風險卵裂期FISH囊胚期FISH平衡易位羅氏易位平衡易位羅氏易位移植1751256842移植妊娠率32%（n=86）28%（n=62）65%(n=44)84%(n=27)流產率12.79%(n=11)12.90%(n=8)9.23%(n=6)7.41%(n=2)目前六十二頁\總數八十二頁\編于十二點所有患者同時移植兩枚胚胎，一枚來自卵裂期或囊胚期活檢的胚胎，一枚來自未活檢的胚胎，采用DNA指紋鑒定妊娠胚胎的來源。—2013卵裂期活檢

-損傷胚胎發育潛能的風險目前六十三頁\總數八十二頁\編于十二點囊胚期活檢較卵裂期活檢對胚胎的發育潛能影響更小；卵裂期活檢

-損傷胚胎發育潛能的風險目前六十四頁\總數八十二頁\編于十二點嵌合對PGS診斷的影響胚胎染色體嵌合現象的概率在25-80%之間，概率范圍大是由于各研究使用胚胎來源、胚胎發育階段及染色體檢測方法的差異。

胚胎嵌合現象示意圖目前六十五頁\總數八十二頁\編于十二點In1993chromosomalmosaicismwasdescribedinhumanpreimplantationembryosforthefirsttime.

---Delhantyetal.1993早期胚胎染色體嵌合的發生率conclusions:Diploid–aneuploidmosaicismisbyfarthemostcommonchromosomalconstitutioninsparehumanpreimplantationembryosafterIVF.Thisunderminesthereliabledeterminationoftheploidystatusofacleavage-stageembryobasedontheanalysisofasinglecell.Futureresearchshoulddeterminetheoriginanddevelopmentalpotentialofmosaicembryos只有9％的胚胎有完全正常的卵裂球--NatMed2009目前六十六頁\總數八十二頁\編于十二點隨著胚胎的發育，嵌合體胚胎比例逐漸降低。ThefateofthemosaicembryochromosomalconstitutionanddevelopmentofDay4,5and8humanembryos.SantosMA,etal.HumanReproduction,Vol.25,No.8pp.1916–1926,2010嵌合對PGS診斷的影響目前六十七頁\總數八十二頁\編于十二點>40%aneuploidcells

<25%aneuploidcells

25-40%aneuploidcells

FISHreanalysisofinnercellmassandtrophectodermsamplesofpreviouslyarray-CGHscreenedblastocystsshowshighaccuracyofdiagnosisandnomajordiagnosticimpactofmosaicismattheblastocyststage,AntonioC,etal.HumanReproduction,Vol.0,No.0pp.1–10,2013真正會影響到移植風險的嵌合胚胎發生率僅為5%.因為絕大多數非整倍體異常在內細胞團與滋養層中共同發生。而在滋養層細胞中可能嵌合存在更多異常。嵌合對PGS診斷的影響目前六十八頁\總數八十二頁\編于十二點如何理解卵裂期活檢的影響（Timelapse分析）正常卵裂球的移除進一步影響胚胎發育的潛能異常卵裂球的存在影響胚胎的正常診斷目前六十九頁\總數八十二頁\編于十二點囊胚活檢有替代卵裂期活檢的趨勢作者認為：卵裂球活檢仍相對更加損傷胚胎，臨床結局顯示囊胚活檢應是最為合適的植入前遺傳學檢測的活檢時期。FertilSteril.2013Sep;100(3):608-14.doi:10.1016/j.fertnstert.2013.07.004.目前七十頁\總數八十二頁\編于十二點極體活檢—風險最低的活檢方法極體活檢對胚胎沒有損傷，隨著極體染色體檢測技術的進步，如更精確而且便宜的測序技術的應用，極體活檢將成為未來PGD/PGS中一項非常有前景的技術。

目前七十一頁\總數八十二頁\編于十二點討論：極體活檢vs囊胚活檢？避免嵌合的影響不影響未來的胚胎僅檢測減數分裂錯誤而未評估有絲分裂錯誤，而有絲分裂可能修復減數分裂錯誤

能分析來自父母雙方的異常嵌合(滋養外胚層可能不能代表內細胞團)

囊胚培養和玻璃化冷凍美國的NathanTreff代表與歐洲的JoepGeraedts達成了許多共識：極體活檢與囊胚活檢各有優勢，不再建議進行卵裂期活檢目前七十二頁\總數八十二頁\編于十二點WilladsenSetal.Hum.Reprod.1999;14:470-475早年PGS嘗試：利用動物MII卵構建人卵裂球分裂相技術難度大，構建成功率低，無法實現臨床應用。全染色體組篩查技術目前七十三頁\總數八十二頁\編于十二點全染色體組篩查技術FISH:

9-11條chr所有23對人染色體都需要篩查CGH-比較基因組雜交aCGH:基因組雜交芯片MicroarraySNPRealTimePCRNextGenerationSequencing目前七十四頁\總數八十二頁\編于十二點全染色體篩查技術進展1996SermonK.,etal.Adaptationoftheprimerextensionpreamplification(PEP)reactionforpreimplantationdiagnosis:singleblastomereanalysisusingshortPEPprotocols.MolHumReprod.1996;2(3):209-212.

(最早用全基因組擴增法進行PGD，但僅篩查幾個基因)1999WellsD.,etal.Detailedchromosomalandmoleculargeneticanalysisofsinglecellsbywholegenomeamplification.NucleicAcidsRes,27:1214-1218.

(首次使用單細胞mCGH做PGS)2005KnijnenburgJ.,etal.Rapiddetectionofgenomicimbalancesusingmicro-arrayconsistingofpooledBACscoveringallhumanchromosomearms.NucleicAcidsRes.2005;12(33):e159.(首次用aCGH做PGS)2007TreffNR.,etal.Accurate23chromosomeaneuploidyscreeninginhumanblastomeresusingsinglenucleotidepolymorphism(SNP)microarray.FertilSteril,2007;86:s217.

(首次用SNParray做PGS)2013EricJ.Forman,etal.Comprehensivechromosomescreeningalterstraditionalmorphology-basedembryoselection:aprospectivestudyof100consecutivecyclesofplannedfresheuploidblastocysttransfer

(首次用qPCR做PGS)2013ChunleiZhang,etal.ASingleCellLevelBasedMethodforCopyNumberVariationAnalysisbyLowCoverageMassivelyParallelSequencing

(首次用NGS做PGS)Pubmed總體能夠搜索到2