第十章

微生物分類與鑒定吉林大學生命科學學院本章內容:一、分類單元二、微生物的命名規則三、微生物分類鑒定的方法四、微生物分類系統五、微生物鑒定例子裸子植物苔蘚類的植物藻類被子植物原生動物海綿動物腔腸動物線蟲類甲殼綱動物昆蟲軟體動物棘皮類動物兩棲動物爬行動物Taraxacum

Dandelion，

isacorruptionoftheFrenchdentdelionmeaning“lion‘stooth”,referringtothecoarselytoothedleaves。Othercommonnamesincludefaceclock,pee-a-bed,wet-a-bed,swine'ssnout,whiteendive,andwildendive.Hungarian：gyermekláncf?

BulgarianandMacedonian

：глухарчеandглуварче

Turkish：karahindiba

Swedish：maskros('wormrose')afterthesmallinsectsusuallypresentintheflowersFinnishandEstonian：voikukkaandv?ilill,respectively,meaning"butterflowerDutch：paardenbloem,meaning"horse-flower".Persian：qasedak(?????),meaningthe"smallpostman"Greek：kleftis(κλ?φτη?)meaning"thief"becauseitisverydifficulttocatchonceairborne.Cyprus：pappous(παππο??)meaning"grandfather"duetothewhite-colouredseedheadresemblingthewhitehairofanolderman.蒲公草、食用蒲公英、尿床草、西洋蒲

公英，鳧公英(《千金方》)、耩褥草(《唐本草》)、蒲公英(《千金翼方》)蒲公英(《本草圖經》)、地丁(《本草衍義》)、金簪草(《士宿本草》)、孛孛丁菜、黃花苗、黃花郎(《救荒本草》)、鵓鴣英(《庚辛玉冊》)、婆婆丁(《滇南本草》)、白鼓丁(《野菜譜》)、黃花地丁、蒲公丁、真痰草、狗乳草(《綱目》)、奶汁草(《本經逢原》)、殘飛墜(《生草藥性備要》)、黃狗頭(《植物名實圖考》)、卜地蜈蚣、鬼燈籠(《草木便方》)、羊奶奶草(《本草正義》)、雙英卜地(《貴>>民間方藥集》)、黃花草、古古丁(《江蘇植藥志》)、茅蘿卜(《四川中藥志》)、黃花三七(《杭州藥植志》)、婆婆丁（遼寧）、仆公罌(《本草圖經集》CarlLinnaeus(CarlvonLinné)卡羅魯斯林奈(1707-1778),瑞典植物學家，分類學之父。建立鑒別生物的標準；將相關生物進行分類；為生物進化提供依據。分類(classification)：根據一定的原則(表型特征相似性或系統發育相關性)對微生物進行分群歸類，根據相似性或相關性水平排列成系統，并對各個分類群的特征進行描述，以便查考和對未被分類的微生物進行鑒定。(根據現有數據建立系統的過程)分類學（Taxonomy

）的具體任務有三個：鑒定分類、命名、命名(nomenclature)：是根據命名法規，給每一個分類群一個專有的名稱。鑒定(identification或determination)：借助于現有的微生物分類系統，通過特征測定，確定未知的、或新發現的、或未明確分類地位的微生物所應歸屬分類群的過程。(根據現有系統確定未知微生物分類歸屬的過程)1.種以上的系統分類單元界Kingdom門Phylum,Division綱Class目Order科Family屬Genus

種Species（基本分類單元）一、分類單元林奈的七級分類單元并把所有生物分為兩界：植物界；動物界。二界1753年林奈三界1866年Haeckel四界1956年植物界動物界原生生物界植物界動物界原始生物界菌界五界1956年植物界Plantae動物界Animalia原生生物界Protista真菌界Fungi原核生物界Monera依據表型特征的分類依據16sRNA和18sRNA序列的同源性，將原核生物分化為細菌和古生菌兩個域，而動物、植物和真菌在進化上更具相關性，合并為真核生物域，1990年美國伊利諾伊大學CarlWoese發表生物三域（Domain）學說。依據生物系統發育的分類種是生物分類中基本的分類單元和分類等級。

微生物的種：指具有高度特征相似性的菌株群，這個菌株群與其他類群的菌株有很明顯的區別。2.種（species）由于細菌分類單元的劃分缺乏一個易于操作的統一標準，為了減少因采用不同標準界定分類單元所造成的混亂，細菌系統分類也像其它生物分類一樣采用“模式概念”種和亞種指定模式菌株（typestrain）；

如：大量的豌豆根瘤菌(Rhizobium

leguminosarum)菌株中，只有菌株USDA2370才是模式菌株。亞屬和屬指定模式種（typespecies）；屬以上至目級分類單元指定模式屬（typegenus）.3.種以下的分類單元1）亞種(subspecies)和變種(variety)：種內的不同菌株存在少數明顯而穩定遺傳的變異特征，這種差異又不足以區分成新種時，可以細分成亞種或變種。2）型(form或type)：常指亞種以下的細分。當同種或同亞種不同菌株之間的性狀差異，不足以分為新的亞種時，可以細分為不同的型。例如：抗原特征的差異，分為不同的血清型；對噬菌體裂解反應的不同，分為不同的噬菌體型3）菌株(strain)：從自然界中分離得到的任何一種微生物的純培養物都可以稱為一個菌株；用實驗方法(如通過誘變)所獲得的某一菌株的變異型，也可以稱為一個新的菌株，以便與原來的菌株相區別。菌株是微生物分類和研究工作中最基礎的操作實體菌株與型的區別：菌株之間不存在鑒別特征的差異，命名不同的菌株無需分類學依據；不同型的細菌之間存在鑒別特征的差異，命名或鑒定不同的型必需有分類學依據。4）培養物（culture）：一定時間一定空間內微生物的細胞群或生長物，如微生物的斜面培養物、搖瓶培養物。5）居群(population)：是指在一定空間中同種個體的組合。二、微生物的命名規則微生物名稱：俗名（commonname）

學名（scientificname）（1）學名國際命名法規：雙名法（林奈發明）：屬名+種名加詞屬名在前，一般用拉丁文名詞表示，字首字母大寫種名在后，常用拉丁文形容詞表示，全部小寫

一般用斜體表示Alcaligenes

denitrificans

subsp.

xylosoxydans屬名種名加詞subspecies亞種名加詞（產堿菌屬）（反硝化的）的縮寫（亞種）（氧化木糖的）

當兩個或多個學名排在一起時，若它們的屬名相同，則后面的屬名可縮寫成1個、2個或3個字母，在其后加一個點。如：Bacillus可縮寫成“B.”或“Bac.”

若所分離的菌株只鑒定到屬而未鑒定到種，用sp.（單數）或spp.（復數）表示。如：Bacillussp.（2）在分類學文獻中

學名=屬名+種名+（首次定名人）+現名定名人+現名定名年份必要（斜體）可省略（正體）（3）三名法

有亞種或變種時，學名由“三名法”構成

學名=屬名

+種名加詞

+subsp

或var+亞種或變種的加詞斜體正體（可省略）斜體（不可省略）三、微生物分類鑒定的方法菌種鑒定步驟：獲得純培養物測定必要的鑒定指標查找權威性的菌種鑒定手冊分類鑒定方法：經典分類鑒定法微生物遺傳型的鑒定細胞化學成分的鑒定現代方法數值分類法（一）經典分類鑒定法形態學特征生理學特征生態學特征經典鑒定指標：生活史，有性生殖情況血清學反應對噬菌體的敏感性其它形態和生理生化特征是最常用的細菌分類、鑒定指標

在生物學表型為指標的傳統方法，正在向微量化、簡便化、快速化、智能化的方向發展。目前，已有商品化的鑒定系統，如：

API系統

“Enterotube”

“Biolog”全自動和手動系統

按大量表型性狀的相似性程度進行統計、歸類

特點:

使用盡可能多的性狀，每個性狀同等重要。

步驟:(1)收集菌株，選擇性狀

(2)性狀編碼

(3)相似性計算:

計算相關系數Ssm（簡單匹配相關系數）或Sj（Jaccard相關系數）：

Ssm=（a+d）/(a+b+c+d)

正負反應性狀

Sj=a/(a+b+c)

正反應性狀

Sj>80~85%種

Sj>65%屬

(4)系統聚類

(5)聚類結果的表示1.

數值分類法（統計分類法）（二）現代分類鑒定方法2.微生物遺傳型的鑒定特點：與形態及生理生化特性的比較不同，對DNA堿基組成的比較和進行核酸分子雜交是直接比較不同微生物之間基因組的差異，因此結果更加可信。（1）DNA堿基比例的測定

測“GC比”：

(G+C)mol%=（G+C）/（A+T+G+C）×100%

分類學上，用G+C占全部堿基的克分子百分數來表示各類生物的DNA堿基組成特征。

DNA堿基組成是各種生物的一個穩定特征，即使個別基因突變，堿基組成也不會發生明顯變化。a）每種生物都有特定的GC%范圍，因此可以作為分類鑒定的指標。細菌的GC%范圍為25-75%，變化范圍最大。b）GC%測定主要用于對表型特征難區分的細菌作出鑒定，從分子水平上判斷物種的親緣關系。c）

GC%的比較，主要用于分類鑒定中的否定親緣關系近的生物，它們應該具有相似的G+C含量，但具有相似G+C含量的生物，并不一定表明它們之間具有近的親緣關系。GC%使用注意事項：同一個種內的不同菌株GC%含量差別應在4～5%以下；同屬不同種的差別應低于10～15%；

GC%含量已經作為建立新的微生物分類單元的一項基本特征，它對于種、屬甚至科的分類鑒定有重要意義。若兩個在形態及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其GC%含量的差別大于5%，則肯定不是同一個種，大于15%則肯定不是同一個屬。熱變性法浮力密度法高效液相色譜法（2）核酸的分子雜交不同生物DNA堿基排列順序的異同直接反映生物間親緣關系的遠近，堿基排列順序差異越小，它們之間的親緣關系就越近，反之亦然。（3）rRNA序列同源性分析rRNA作為進化和系統分類指征的優點：a）rRNA具有重要且恒定的生理功能；b）在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列區域，又有中度保守和高度變化的序列區域，因而它適用于進化距離不同的各類生物親緣關系的研究；c）16SrRNA分子量大小適中，便于序列分析；d）rRNA在細胞中含量大(約占細胞中RNA的90%)，也易于提取；e）16SrRNA普遍存在于原核生物中(真核生物中其同源分子是18SrRNA)。因此它可以作為測量各類生物進化的工具。一些生物大分子（如16SrRNA或18SrRNA），其分子序列的改變量與分子進化的時間成正比，因此，這些生物大分子被作為分子計時器，真實記錄了各種生物的進化過程。可通過比較不同類群的生物大分子序列的改變量來確定它們彼此系統發育的相關性或進化距離。分子計時器：（3）rRNA序列同源性分析三種方法：

rRNA-DNA雜交、

rRNA寡核苷酸編目分析

rRNA基因序列分析（系統發育樹狀圖）。分析不同微生物16SrRNA或18SrRNA寡核苷酸序列的同源性程度，以確定不同生物間的親緣關系和進化譜系。T1RNA酶水解（專一性水解G上3’端磷酸酯鍵）提純rRNA（32P標記）一系列寡核苷酸片段（長度不一以G為末端）雙向電泳分離，確定rRNA寡核苷酸的指紋圖譜寡核苷酸序列分析（6個核苷酸以上）編目，比較、計算和分析確定菌株間的親緣關系rRNA寡核苷酸編目分析實驗方法：rRNA寡核苷酸編目分析的基本原理：用一種RNA酶水解rRNA后，產生一系列寡核苷酸片段，如果兩種或兩株微生物的親緣關系越近，則其所產生的寡核苷酸片段的序列也接近，反之亦然。（4）微生物全基因組序列測定第一個古菌：詹氏甲烷桿菌第一個細菌：流感嗜血桿菌第一個真菌：釀酒酵母3.

細胞化學成分用作鑒定的指標

細胞壁的化學成分全細胞水解液的糖型磷酸類脂成分的分析枝菌酸的分析醌類的分析脂肪酸組成和代謝產物分析好氧放線菌類的化學分類檢索表二氨基庚二酸二氨基庚二酸

《伯杰氏鑒定細菌學手冊》(Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology)

第一版（1923年）~第八版（1974年）~第九版（1994年）美國賓夕法尼亞大學的細菌學教授伯杰(D.Bergey)

主編。1957年第七版后，吸收了國際上細菌分類學家參加編寫，它的近代版本反映了出版年代細菌分類學的最新成果，因而逐漸確立了在國際上對細菌進行全面分類的權威地位。四.微生物分類系統1.原核生物分類系統1984~1989年改為《伯杰氏系統細菌學手冊》，簡稱《系統手冊》(Bergey’sManualofSystematicBacteriology)（第一版，分四卷）第二版，分五卷（根據系統發育資料，對分類單元進行了相當大的調整）第一卷：古生菌、藍細菌、光合細菌以及最早分支的細菌（2001）第二卷：變形桿菌（2005），分為三本：2A（Introductoryessays）;2B(TheGammaproteobacteria);2C(Otherclassesofproteobacteria)第三卷：硬壁菌門(Firmicutes)(2009)第四卷：TheBacteroidetes,Spirochaetes,Tenericutes,Acidobacteria,Fibrobacteres,Fusobacteria,Dictyoglomi,Gemmatimonadetes,,,,(2011)第五卷：放線菌門（Theactinobacteria）intwoparts(2012)伯杰氏手冊是目前進行細菌分類、鑒定的最重要依據，其特點是描述非常詳細，包括對細菌各個屬種的特征及進行鑒定所需做的實驗的具體方法。2.

菌物分類系統Ainsworth菌物系統（Ainsworth’ssystemoffungi）

第七版(1983年)

第八版(1995年)

影響力較大高溫產氫菌的分離篩選與鑒定應用新能源厭氧發酵產氫的微生物高溫產氫菌的富集

高溫產氫菌的篩選產氫菌的分離高溫產氫菌的分離篩選可降解纖維素厭氧產氣氫菌的富集菌種來源：長白山溫泉。培養條件：用80%N2+20%CO2混合氣來提供厭氧環境，75℃、120rpm振蕩培養。培養基：DSMZ516(濾紙做碳源)高溫產氣菌的快速分離瓊脂糖濃度：1.2%碳源：1%的纖維二糖菌液稀釋倍數：105產氣菌的挑取：利用滅菌后的微量進樣器將固體培養基中氣泡周圍的細菌轉接到液體培養基中。20mL40mL60mL60℃靜置培養高溫產氫菌的純化Hungate滾管技術培養條件：培養基體積10mL，60℃靜置培養。瓊脂糖濃度：1.2%碳源：1%的纖維二糖菌液稀釋倍數：105培養四天后，挑取單克隆，轉接到新鮮培養基中，共得到三株菌。倒置小管實驗，篩選高溫產氫菌結果如上圖，圖中從左到右分別為：對照試驗（不接種），分離得到的菌種1,2,3從上述結果可以看到試管4的產氣量最高，命名為CBS-Z.1234多相分類學鑒定基因型分析形態學特征生理生化特征16SrRNA及系統發育學分析脂肪酸成分分析形態學特征Scanningelectronmicroscopyat×10,000(A)andTransmissionelectronmicrographsofpositivelystainedcellsofstrainCBS-ZT(B).

1）CBS-Z革蘭氏染色呈陽性。2）透射電鏡觀察結果顯示CBS-Z細胞呈短桿狀，CBS-Z大小約2~3×0.5–0.7μm，沒有鞭毛。3）菌斑呈白色，圓形，凸起于培養基表面，邊緣光滑。AB生理生化特征碳源是否生長Acetate–Arabinogalactan+Avicel+Arabinose+Carboxymethylcellulose+Casein–Cellobiose+Filterpaper+Fructose+Galactose+Glucose+Lactose+Maltose+Pectin+Sorbitol+Starch+Sucrose+Trehalose+Xylan+Xylose+Yeastextract+CBS-Z碳源利用情況

抗生素敏感測定抗生素

生長情況（10ug/ml）生長情況（100ug/ml）新霉素－－四環素

+－氯霉素++紅霉素－－羧芐青霉素+－氨芐青霉素

+－硫酸鏈霉素++硫酸卡那霉素+－生長因子測定脂肪酸成分分析FattyacidscompositionofstrainCBS-Ziso-C17:0（54.78%）、iso-C14:0

3-OH(12.93%)和C16:0(9.63%)，占脂肪酸含量的77.34%。。占脂肪酸總含量的90%以上，與嗜熱菌中飽和脂肪酸所占比例高這一事實相符，能充分說明細胞壁的耐熱性機制，這一點也與CBS-Z的最適溫度較高相符。脂肪酸百分含量13:0ISO0.3314:0ISO3OH12.9314:00.5815:0ISO5.3916:0Nalcohol0.4116:0ISO2.5316:09.63SumInFeature44.2817:0ISO54.7817:0ANTEISO1.0717:0CYCLO0.5518:00.6719:0ISO0.4519:02.6120:4w6,9,12,15c1.10基因組DNA的提取和GC含量測定Tm值為68.5℃（G+C）mol%含量為36.08mol％ 參比菌株Caldicellulosiruptorbescii(=DSMZ6725T)基因組DNA的G+C含量測定值為38.3mol％，與文獻報道的36.7mol％相差1.6mol％，證明了本實驗所使用的儀器和方法的有效性。ThedenaturalizationcurveofCBS-ZgenomicDNA.T