間接免疫熒光實驗第1頁，共13頁，2023年，2月20日，星期四實驗原理固定在載片上的靈長類肝組織和HEp-2細胞與適當稀釋的待檢血清反應后,如果待檢血清中有ANA,就會與細胞核成分特異結合,加入FITC標記的的羊抗人IgG抗體又可與ANA結合,在熒光顯微鏡下可見細胞核部位呈現熒光。第2頁，共13頁，2023年，2月20日，星期四試劑與器材1.抗原片2.熒光標記的二抗3.PBS-Tween緩沖液4.陰、陽性參考血清5.封片介質:磷酸鹽緩沖甘油6.蓋玻片7.器材:熒光顯微鏡、搖床、脫色缸、吸管、試管等第3頁，共13頁，2023年，2月20日，星期四生物薄片生物薄片馬賽克：將包被有不同基質的生物薄片固定在一個載片反應區中，可同時檢測多種抗不同組織或病原體的抗體。第4頁，共13頁，2023年，2月20日，星期四滴定平板技術：使實驗操作標準化

將標本或試劑滴加到加樣板反應區上，然后把生物薄片載片蓋在加樣板的凹槽里，所有生物薄片均與液滴接觸，反應同時開始.系統的幾何結構決定了液滴的位置和高度.第5頁，共13頁，2023年，2月20日，星期四熒光二抗熒光素發射的熒光色激發波長（nm）發射波長（nm）異硫氰酸熒光素（FITC）

綠495528熒光素及其激發波長和發射波長第6頁，共13頁，2023年，2月20日，星期四熒光顯微鏡：

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落射式熒光顯微鏡①不需要額外的聚光鏡②可產生高對比度的暗視野③同時進行明視野、暗視野的抗原基質定位④可觀察兩種不同的熒光⑤可改變熒光的強度第7頁，共13頁，2023年，2月20日，星期四IIF操作步驟１．準備：檢查加樣板是否反應區親水而周邊疏水。從試劑盒中取出載片，等平衡到室溫時方可打開包裝。注意不要觸及生物薄片。用筆編號、標記。２．稀釋：用磷酸鹽緩沖液1:100稀釋血清。注意：陽性和陰性對照不需稀釋，使用前要混勻３．加樣：將加樣板放在泡沫板上，按順序分別滴加25ul稀釋后的血清至加樣板的反應區中，避免產生氣泡。滴加完所有待測標本后才開始溫育。４．第一次溫育：將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里，反應立即開始。確保每一個標本均與生物薄片接觸，且標本間互不接觸。室溫溫育30分鐘。５．清洗：用磷酸鹽緩沖液流水沖洗載片1秒鐘（注意水流不要太急，不要直接對著基質沖），然后立即將其浸入裝有磷酸鹽緩沖液的脫色缸中浸洗5分鐘。第8頁，共13頁，2023年，2月20日，星期四６．加樣：滴加20ulFITC標記的羊抗人IgG至潔凈加樣板的反應區中，完全加完所有的二抗后，方可繼續溫育。注意：標記的IgG使用前需混勻。７．第二次溫育：從磷酸鹽緩沖液中取出一張載片，用吸水紙擦一下背面和邊緣后，立即將載片覆有生物薄片的一面朝下，蓋在加樣板的凹槽里。注意：為防止破壞基質，不要擦拭反應區的間隙。檢查生物薄片是否與液滴接觸良好，注意避免陽光直射載片。８．清洗：同上。９．封片：將蓋玻片直接放在泡沫板的凹槽里。滴加10ul封片介質至蓋玻片每一反應區。從磷酸鹽緩沖液中取出一張載片，用紙擦干背面和四邊，注意不要擦拭反應區間隙。將載片覆有生物薄片的一面朝下放在已準備好的蓋玻片上，立即查看并輕輕調整使蓋玻片嵌入到載片的凹槽里。１０．結果判斷：熒光顯微鏡下觀察特異的熒光模型。第9頁，共13頁，2023年，2月20日，星期四以HEp-2細胞為基質檢測ANA免疫熒光模式均質型

顆粒型核仁型核膜型第10頁，共13頁，2023年，2月20日，星期四實驗報告陰性：檢測系統正常，待測標本在合適的起始稀釋度下，實驗基質沒有明顯的熒光染色（與陰性對照在同一水平），或沒有可以辨認的熒光模式

陽性：檢測系統正常，待檢標本在合適的起始稀釋度下，產生明顯高于陰性對照的特異熒光，且有明顯可以辨認的熒光模式

免疫熒光模式：陽性結果應報告

滴度：與相同稀釋倍數的陰性血清比較，能觀測到特異性熒光反應的最高稀釋度，報告滴度利于病情監測第11頁，共13頁，2023年，2月20日，星期四陽性標本經系列稀釋后可測出其滴度。最適稀釋因子為3.162（10的平方根），這樣，每隔一步就出現一個10的整數倍數（1:10、1:32、1:100、