細胞周期的調控與檢測第1頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二細胞周期及其調控機制蘇川chuansu@南京醫科大學病原生物學系86862774江蘇省病原生物學重點實驗室86862773第2頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二提綱一、基本概念介紹二、歷史回顧三、細胞周期各時相的動態變化四、細胞周期的調控五、細胞周期得以進行的兩大機制六、細胞周期的界面機制七、腫瘤與細胞周期八、常用的細胞周期檢測方法第3頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二

生命是如何生長、生存、繁衍和死亡？在每一個生命個體中都存在一個精密的程序，或生物鐘。生物鐘決定著細胞是否、何時生長、分裂、或死亡。這就是細胞周期調控機制，它在相關基因的控制下，依據一定的規則和節奏運行著，調控細胞的生長、分裂和死亡。在胚胎細胞，細胞周期保持快速運行，在一些成年細胞中其運行慢得多，而在神經元細胞細胞周期幾乎完全不運行。在生長過程中的細胞，如果細胞周期不能運行，結果是死亡。而在成熟細胞，細胞周期不正確的運行，結果則是腫瘤的發生。細胞周期(cellcycle)細胞周期調控(cellcycleregulation)“細胞周期”也稱“細胞分裂周期”，是指一個細胞經生長、分裂而增殖成兩個所經歷的全過程，通?？煞譃槿舾呻A段，即G1期、S期、G2期和M期。細胞在G1期完成必要的生長和物質準備，在S期完成其遺傳物質——染色體DNA的復制，在G2期進行必要的檢查及修復以保證DNA復制的準確性，然后在M期完成遺傳物質到子細胞中的均等分配，并使細胞一分為二。一、基本概念介紹第4頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二2001NobelPrizeLelandH.Hartwell1970s“Checkpoint”Yeastgenetics~100CDCgenesStartgeneTimHunt1980sCyclinsSeaUrchinsPaulM.Nurse1970sCDKsyeast二、歷史回顧第5頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二生命復制之謎的揭開

（1）1858年建立細胞理論：生命的基本形式是細胞，機體由細胞構成，細胞的生長復制形成了生物體的生長繁衍，細胞的異?；蛩劳鰧е聶C體的疾病或死亡。

（2）1951年發現了細胞分裂周期：G1SG2MG0細胞生長中有兩種形式----有絲分裂期和細胞間期細胞周期細胞間期有絲分裂期（M期）DNA合成前期（G1期）DNA合成期（S期）DNA合成后期（G2期）前期中期后期末期第6頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二第7頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二第8頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二細胞分裂周期圖第9頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二（3）隨著成熟刺激因子（maturationpromotingfactor,MPF），細胞周期素（cyclin），細胞周期素依賴性蛋白激酶(cyclin

dependentkinase，CDK)的發現使對細胞周期及與腫瘤的發生發展關系的研究有了很大進展第10頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二第11頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二三、細胞周期各時相的動態變化１、G1期（DNA合成前期，指有絲分裂完成到DNA合成之前的一段時間）

RNA在此期大量合成，導致蛋白質量明顯增加。S期所需的DNA復制相關的酶系，如DNA聚合酶，G1期向S期轉變相關的蛋白質如觸發蛋白、鈣調蛋白、細胞周期蛋白等均在此期合成。蛋白質的磷酸化作用在G1期開始增加，，這將有利于G1晚期染色體結構成分的重排。非組蛋白、一些蛋白激酶在G1期也可發生磷酸化，已知大多數蛋白激酶磷酸化發生于其絲氨酸或蘇氨酸、酪氨酸部位。

第12頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二觸發蛋白是一種不穩定蛋白，它對細胞從G1期進入S期是必須的。只有當其含量積累到臨界值，細胞周期才能朝DNA合成方向進行。鈣調蛋白是真核細胞內重要的鈣受體，它調節細胞內鈣的水平，鈣調蛋白的含量，在G1晚期可達峰值，用抗鈣調蛋白藥物處理細胞，可延緩其從G1期到S期的進程。G1期蛋白質量的增加，可能與蛋白質合成增強有關，而另一原因則可能使其降解的減弱。第13頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二２、S期（DNA合成期，從DNA合成開始到DNA合成結束的全過程，是細胞增殖周期的關鍵階段）S期是細胞進行大量DNA復制的階段，組蛋白及非組蛋白也在此期大量合成，最后完成染色體的復制（１）DNA復制需要多種酶的參與包括DNA聚合酶、DNA連接酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、核苷酸還原酶等。隨著細胞由G1期進入S期，這些酶的含量或活性可顯著增高（２）DNA復制具有嚴格的時間順序通常，GC含量較高的DNA序列在早S期復制，晚S期復制的主要為ＡＴ含量高的DNA序列；就染色體而言，常染色質的復制較異染色質要早，典型的例子如人女性的細胞中，當其它染色體都被復制完以后，才開始進行純化的X染色體復制。第14頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二（３）S期是細胞合成的主要時相

此時細胞質中可出現大量的組蛋白mRNA，新合成的組蛋白從胞質進入胞核，與復制后的DNA迅速結合，但繞成核小體，進而形成具有兩條單體的染色體。除了蛋白質合成以外，在S期細胞中不斷進行著組蛋白的持續磷酸化。（４）中心粒的復制也在S期完成

原本垂直的一對中心粒發生分離，各自在其垂直方向形成一個子中心粒，由此形成的兩對中心粒在以后的細胞周期進程中，將發揮微管組織中心的作用，紡錘體微管，星體微管的形成均與此相關。第15頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二３、G2期（DNA合成后期，從DNA復制完成到有絲分裂開始前的時期，為有絲分裂

進行物質條件）

為細胞分裂準備期，細胞中合成一些與M期結構功能相關的蛋白質，與核膜破裂，染色體凝集相關的成熟促進因子在此期合成。微管蛋白G２期合成達高峰，為M期紡錘體微管的形成提供了豐富的來源。已經復制的中心粒在G2期逐漸長大，并開始向細胞兩極分離。４、M期（有絲分裂期，細胞經過分裂將染色體平均分配到兩個子細胞中）在此期細胞中，染色體凝集后發生姊妹染色單體的分離，核膜核仁破裂后再重建，胞質中有紡錘體收縮環出現，隨著兩個子核的形成，胞質也一分為二，由此完成細胞分裂。第16頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二G1期：為DNA合成準備所需要的RNA、蛋白質、脂類、糖類等G1早期：細胞的生長G1晚期：為S期的DNA合成做準備S期（DNA合成期）

DNA合成(復制)染色體蛋白的合成：組蛋白、非組蛋白等中心粒的復制G2期（DNA合成后期）有活躍的RNA和蛋白質合成微管蛋白，促有絲分裂因子（MPF）中心粒向兩極移動M期（有絲分裂期）

DNA、RNA、蛋白質合成停止。細胞發生一系列形態變化、結構建成。將加倍的DNA平均分配到兩個子細胞中第17頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二細胞周期調控研究過程的重要事件---MPF的發現：MPF是一種在G2期形成，能促進M期啟動的調控因子，稱之為促細胞成熟因子或促細胞分裂因子（MPF)。MPF由調節亞單位細胞周期素（cyclin）和催化亞單位細胞周期素依賴性蛋白激酶（CDK）組成。1、細胞周期調控蛋白（cellcycle-regulatingprotein)四、細胞周期的調控第18頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二2）細胞周期調控蛋白的種類A、CDK類蛋白激酶：CDK與細胞周期素結合才具有激酶的活性，故名細胞周期素依賴性蛋白激酶(cyclin-dependentkinase，CDK).作用：CDK可將特定蛋白磷酸化，促進細胞周期運行。在動物中已知7種CDK，CDK1-7。B、細胞周期素（cyclin)特點：在細胞周期中呈周期性變化。作用：能與CDK結合，激活CDK，間接調節細胞周期運行。已知30余種，在脊椎動物中為cyclinA1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。第19頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二Cyclins與CDKs結合后，CDKs才具有活性，它們兩者的結合使細胞周期有序進行。具體結合方式如下：第20頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二C、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)CKI對細胞周期起負調控作用，分為：Ink4:P16ink4a,P15ink4b,P18ink4c,P19ink4d。特異性抑制cdk4-cyclinD1,cdk6-cyclinD1。Kip：P21cip1、P27kip1、P57kip2，抑制大多數CDK的激酶活性。P21cip1還能與DNA聚合酶δ的輔助因子PCNA結合，直接抑制DNA的合成。作用機制：未完全清楚，大多數CKI是通過直接與Thr160/161磷酸化后的CDK-cyclin復合物密切結合，直接抑制其蛋白激酶活性?，F較為肯定的是p21，其調控水平在基因轉錄的層面，當DNA損傷和細胞衰老時，具有轉錄因子作用的p53增高，抑制其蛋白激酶活性，阻滯細胞周期的進行。第21頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二第22頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的積累。結合M-cyclin的CDK1被Wee1（抑制因子）將Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不斷積累。在M期，Wee1的活性下降，CDC25磷酸酶使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障礙。CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CAK)的作用下完成的。3）M期CDK的激活第23頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二CDKactivating活性位點抑制位點第24頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二由于某些環境因素的作用細胞周期出現故障或差錯，這些信號可是細胞停留在某些點上，稱為限制點。主要檢驗點：G1/S限制點：DNA是否損傷？細胞外環境是否適宜？細胞體積是否足夠大？在酵母中稱start點，在哺乳動物中稱R點(restrictionpoint)。S期限制點：DNA復制是否完成？G2/M限制點：DNA是否損傷？細胞體積是否足夠大？中-后期限制點：紡錘體組裝限制點。2、細胞周期限制點（checkpoint）第25頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二Fourcheckpoints第26頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二3、細胞周期中的信號系統調控

單細胞生物的增殖取決于營養，多細胞生物細胞的增殖與信號途徑有關。A、生長因子：是與細胞增殖有關的信號物質，已知幾十種，多數能促進細胞增殖，又稱有絲分裂原（mitogen），如EGF、NGF。作用方式：旁分泌。信號通路：ras途徑，cAMP途徑、磷脂酰肌醇途徑。B、抑素（chalone)是一種由細胞自身產生、分泌的，對細胞增殖起抑制作用的糖蛋白，與膜上的受體結合，引起信號轉換及在胞內傳遞，影響細胞周期相關的蛋白的表達。具有嚴格的組織特異性和細胞周期階段特異性。作用于G1期的抑素可阻止細胞進入S期，稱S因子。作用于G2期的抑素可阻止細胞進入M期，稱M因子。第27頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二五、細胞周期得以進行的兩大機制

細胞周期得以進行的核心機制是在一系列cyclin時相起伏的調控下，相應的CDK依次激活，驅使細胞通過G1,S,G2期，達到M期，細胞一分為二，實現忠于親代的細胞復制。這一過程的順利完成取決于是否啟動和能否忠于運行，達到忠實復制，是細胞周期調控的兩大生物學機制。第28頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二1、細胞周期的啟動機制

細胞周期能否啟動進行細胞增殖，主要的調控點在G1期，它決定細胞是否通過G1期進入S期。這一調控點首先在芽殖酵母的研究中被認識，人們稱其為“起始點”（START）。一旦細胞通過start,它們勢必進入S期，完成整個細胞分裂周期。因此start有人稱之為酵母細胞周期的“決定點”。在人體細胞增殖中，在G1期存在相似的調控機制。在G1期較晚時，也有一個決定點，稱為“限制點”（restrictionpoint），與酵母的START功能類似，不同的是，人類細胞是否通過“限制點”，進入細胞周期，主要受與細胞增殖有關的細胞外生長因子的調控，而不是營養素。只要有相應的生長因子存在，細胞就能通過R點進入S期，完成整個細胞周期?；氐紾0/1期。相反，如果細胞在G1期就缺乏相應的生長因子，細胞周期的運行將停止在R點，此時細胞進入“安靜狀態，稱之為G0期。第29頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二連接信號轉導與細胞周期有兩條途徑，一是cyclin－D/CDK4，二是cyclinE/CDK2。二者都是G1期進行的限速步驟，即cyclinD或cyclinE的過度表達，均能縮短G1期時間或加速G1期進行第30頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二2、細胞周期的監控機制

DNA損傷檢測點抑癌基因p53在人類細胞周期G1期檢測點起著關鍵性作用。還存在G2期檢測點。時相次序監測點MPF(有絲分裂促進因子)，可以誘導所有細胞周期時相的細胞核發生染色體凝集。SPF(S期促進因子)，只能誘發G1期細胞進入S期而不能使G2期細胞進入M期。第31頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二六、細胞周期的界面機制1、細胞周期與DNA修復所有的真核細胞中都高度保守者這一整套完整的精密機制，承擔著DNA損傷、錯誤地發現，并將其信號傳遞給相應的機制，，去阻滯細胞周期的運行，并同時進行DNA損傷的修復。然后視修復情況，細胞基因的突變。決定繼續分裂或死亡，執行一系列細胞的重要生命活動。DNA修復方式切除修復錯配修復:將局部一段錯配的寡核苷酸鏈切除，重新合成之堿基切除修復核苷酸切除修復全基因組切除修復轉錄切除修復第32頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二2、細胞周期與細胞凋亡細胞凋亡存在有細胞周期特異性，不同因素誘導的細胞凋亡發生在細胞周期不同的時相3、細胞周期與細胞分化細胞周期不僅與細胞增殖、細胞凋亡有關，還調控著細胞分化第33頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二1、細胞周期與腫瘤的關系目前從多方面對腫瘤進行了深入研究（流行病學、病因學、遺傳），腫瘤是多因素，多步驟，多階段的。但是腫瘤的惡性增生從生物學角度看，主要表現在兩方面：一是腫瘤細胞的不滅性，即細胞凋亡障礙；二是細胞增殖失控，程序發生紊亂，只是增殖超常加快。這兩方面均已成為腫瘤發生發展研究的熱點。通過研究發現了1.存在于正常細胞內的原癌基因發生錯誤轉變為癌基因2.一些基因失活后正常細胞轉變為癌細胞—抑癌基因。經過70年代的癌基因時代，80年代的抑癌基因時代90年代的多基因時代或癌基因蛋白網絡時代，提出了一系列的理論：腫瘤多步驟里論、DNA修復理論、細胞凋亡理論，進一步闡明細胞周期核心機制、細胞周期啟動機制、細胞周期檢測點機制。七、腫瘤與細胞周期第34頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二2、

腫瘤細胞中細胞周期檢控機制的破壞細胞周期中檢測DNA損傷的檢測點至少有兩處：一處在G1-S過渡期：控制進入S期的檢測點，防止DNA受損細胞進入S期的DNA復制。另一處在G2-M過渡期：控制進入M期的檢測點，防止受損的DNA和未完成復制的DNA進入有絲分裂。這些DNA損傷檢測點的主要機制有二：一是p53依賴性機制，另一是p53非依賴性機制每一個完整的檢測點應由四部分組成，即發現或傳感器（detect或sensor）、制動或拘留（stoporarrest）、修復（repair）、決定（decision，divideordeath）。理論上說監測點的任何一部分出了問題，都會導致功能的異常，結果是遺傳不穩定，基因受損的細胞存活和復制或細胞遺傳物質的改變，如此細胞多步驟進化，最終成為失控性生長的腫瘤細胞。第35頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二3、腫瘤細胞中細胞周期驅動機制的破壞細胞周期監測點功能的減弱，導致突變基因的累積和正常細胞的進化，只有當這些累積的突變基因破壞了細胞周期驅動機制，細胞才能進入失控性生長的境界。人們把細胞周期驅動機制比作一輛汽車或引擎，驅使其運行的因素好比“油門”；制動器運行的機制猶如“剎車”。持續地踏住“油門”或“剎車”失靈，終將失控。這正是致變因素導致基因突變，檢測點基因突變，突變基因累積，驅動機制失控的必然結果。腫瘤的發生發展過程中，監控機制破壞的典型例子是P53.基因的突變。大約50%的人類腫瘤都存在P53.基因的突變，說明DNA損傷檢測點在腫瘤的發生、發展中，具有重要的位置。第36頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二From:BritishJ.Cancer87:129-133第37頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二1:222-231MutationofG1/Sregulatorsinhumancancer第38頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二八、常用的細胞周期檢測方法流式細胞術PI(碘化丙錠),可以與細胞內DNA和RNA結合,采用RNA抑制劑將RNA消化后,通過流式細胞術檢測到的與DNA結合的PI的熒光強度直接反映了細胞內DNA含量的多少。由于細胞周期各時相的DNA含量不同,因此,通過流式細胞術PI染色法對細胞內DNA含量進行檢測時,可以將細胞周期各時相區分為G1/G0期,S期和G2/M期,并可通過特殊軟件計算各時相的百分率:G1/G0期具有二倍體細胞的DNA含量(2N),G2/M期具有四倍體細胞的DNA含量(4N),S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。值得注意的是,PI不能通過細胞膜完整的細胞(如活細胞和早期凋亡細胞),在標本制備時,必須先用乙醇或其他破膜劑增強細胞膜的通透性,才能使PI進入細胞內與細胞內的核酸結合。乙醇通常為終濃度為70%的冷乙醇。第39頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle

PurdueUniversityCytometryLaboratories第40頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二G1SphaseG2MG1121DNAcontentTheCellCycleDNAcontentbyflowcytometryDeconvolutionintocellcyclephasesG0/1G2/MSEvents第41頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二MeasurementofsubG0/1apoptoticparticlesDNAcontentEventsEventsG0/1G2/MSApoptosis第42頁，共46頁，2023年，2月20日，星期二4hr,control28hr,irradiatedG1:94.1%S:1.5%G2/M:4.4%G1:94.1%S:1.1%G2/M:4.8%G1:60.6%S:34.9%G2/M:4.5%G1:96.6%S:1.6%G2/M: