植物組織培養1第1頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五2本講主要內容：一、植物組織培養的理論基礎二、植物組織培養操作技術第2頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五知識點:基本概念：有性生殖、無性生殖、植物細胞全能性、細胞分化、脫分化、再分化、愈傷組織等；植物離體培養中再生植株有哪些途徑？愈傷組織是如何形成與生長的？3第3頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五一、植物組織培養的理論基礎1、植物的無性繁殖：不經過精、卵細胞的結合，而是通過母體的部分組織或器官來進行繁殖的方式。4第4頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五植物的全能性：1879年Hansen提出，即植物體的部分組織或器官具有發育成完整植株的潛在能力，稱之為植物的全能性。2、植物細胞的全能性（Totipotency）植物細胞的全能性：1902年由Haberlandt提出，每一個植物細胞具有該植物的全部遺傳信息，都有分化成一個完整植株的潛在能力。5第5頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五外植體：植物組織培養中用來進行無菌培養的離體材料，可以是器官、組織、細胞和原生質體等葉片莖段種子莖尖

6第6頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五細胞全能性的相對性:細胞全能性并不意味著任何細胞均可以直接產生完整植株;動植細胞全能性的表現程度存在明顯的差異.7第7頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五一個植物細胞向分生狀態回復過程所能進行的程度，取決于它在自然部位上所處位置和生理狀態。8植物細胞全能性表現根據細胞類型不同，其全能性表現從強到弱依次為第8頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五根據細胞所處的組織不同從強到弱：頂端分生組織>居間分生組織>側生分生組織>薄壁組織（基本組織）>厚角組織>輔導組織>厚壁組織9第9頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五

植物細胞全能性理論是植物組織培養的核心理論。離體細胞具有生命的特征屬性，在全能性的基礎上，提供合適的營養和環境條件，離體細胞經歷脫分化和再分化過程，可形成再生植株。10第10頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五3、植物細胞物細胞全能性的實現途徑細胞全能性脫分化個體再生再分化細胞分裂

細胞全能性的表達是通過細胞脫分化和再分化實現的，在大多數情況下，脫分化是細胞全能性表達的前提，再分化是細胞全能性表達的最終體現。11第11頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五3.1植物細胞的再分化分化：是指植物體各個部分出現異質性的現象，體現在細胞分化、組織分化、器官分化三個水平上。12第12頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五細胞分化：是指導致細胞形成不同結構或引起功能改變或潛在發育方式改變的過程。細胞分化是組織分化和器官分化的基礎，是離體培養再分化植株再生得以實現的基礎。13第13頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五脫分化（去分化）：是指離體培養條件下生長的細胞、組織或器官經過細胞分裂或不分裂，逐漸失去原來的結構和功能而恢復分生狀態，形成無組織結構的細胞團或愈傷組織，或成為未分化細胞特性的過程。3.2植物細胞的脫分化愈傷組織：脫分化后的細胞，經過細胞分裂，產生無組織結構、無明顯極性、松散的細胞團稱為愈傷組織。14第14頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五15第15頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五

脫分化誘導期間會導致細胞膜透性改變，細胞核增大，內質網范圍擴大，多核糖體形成，過氧化物酶增加，蛋白質和酚類物質合成活躍等。但目前對于脫分化的機理尚未完全闡明。脫分化的機理16第16頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五

注意：

魔芋體細胞胚a并不是所有的細胞脫分化的結果都必然形成愈傷組織。有些植物體的細胞脫分化以后直接形成胚性細胞，進而形成體細胞胚；

b多數愈傷組織內的細胞并不都是未分化的細胞，即同一愈傷組織內的細胞之間其狀態存在一定的差異。17第17頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五（1）損傷：切割損傷的刺激，促使細胞增殖。（2）生長調節劑：離體培養下的器官分化在大多數情況下是通過外源提供適宜的植物生長調節劑來實現的。種類、濃度和不同類型生長調節劑的比例是影響根、芽等分化的關鍵。影響脫分化的主要因素18第18頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五

一般情況下,高的生長素/細胞分裂素濃度比的情況下，有利于根的的形成，反之有利于芽的形成。而當生長素和細胞分裂素含量相當時，有利于愈傷組織的生長。19第19頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五NAA（愈傷組織一定量）A：NAA0mg/L，芽（多），根（無）B：NAA0.1mg/L，芽（多），根（無）C：NAA5.0mg/L，芽（少），根（多）ABC20第20頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五BA（愈傷組織一定量）A：BA(0mg/L)，芽（減少），根（增多）B：BA(0.1mg/L)，芽（增多），根（減少）AB21第21頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五（3）光照：弱光或黑暗條件有利于脫分化中的細胞分裂（即愈傷組織的誘導）。（4）溫度：愈傷組織誘導培養時，溫度可以適當提高，而分化溫度比誘導溫度要低。（5）細胞位置：外植體本身的各類細胞可能對培養條件的刺激有不同的敏感性。22第22頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五23第23頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五（6）外植體的生理狀態：不同生理年齡和不同季節都會有不同的培養反應。（7）植物種類的差異：一般雙子葉植物比單子葉植物及裸子植物容易。24第24頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五3.3植物細胞的再分化

指是脫分化后的分生細胞（愈傷組織）在一定的條件下，重新分化為各種類型的細胞、組織、器官的，甚至形成完整植株的過程。

25第25頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五3.3植物的形態建成

愈傷組織的形成

在細胞脫分化過程中，大多數情況下形成愈傷組織。愈傷組織的誘導形成是一個內、外環境因素相互作用的復雜過程，可分為誘導期、分裂期和分化期。

26第26頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五誘導期（起動期）：是細胞準備分裂的時期。細胞大小幾不變，內部發生生理生化變化，迅速合成蛋白質和核酸。分裂期：分裂期是指外植體細胞經過誘導以后脫分化，不斷分裂、增生子細胞的過程。分化期：是指細胞內出現一系列形態和生理上的變化，從而使愈傷組織內產生不同形態和功能上的細胞。如薄壁細胞、分生細胞、色素細胞、纖維細胞等。27第27頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五黑暗條件下培養地煙草愈傷組織28第28頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五愈傷組織的保持-轉接隨著愈傷組織的分化，如果在原培養基上繼續培養愈傷組織，會由于培養基中營養不足或有毒代謝物的積累，導致愈傷組織停止生長，甚至老化變黑、死亡。如果要讓愈傷組織繼續生長增殖，必須定期（如2~4周）將它們分成小塊，接種到新鮮的培養基上，這樣愈傷組織就可以保持長期旺盛的生長。29第29頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五器官分化經過起動、分裂和分化期產生的愈傷組織，其中雖然發生了細胞分化，但是并沒有器官發生。只有滿足某些條件，愈傷組織的細胞才會發生再分化，形成不同的器官原基（如不定芽、不定根），進而發育成完整植株。

30第30頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五愈傷組織的形態發生方式主要有器官發生和胚狀體發生兩條途徑。器官發生是在某些條件下，愈傷組織中的分生細胞發生分化，形成不同的器官原基，再逐漸形成芽和根。31第31頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五

胚狀體（體細胞胚）發生:是由愈傷組織形成類似種子的胚的結構，同時產生芽端和根端的結構，稱為胚狀體。32胚狀體經歷與合子胚相似的發育過程，從球形胚、心形胚、魚雷胚到成熟胚。第32頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五33第33頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五

根據起源不同，器官發生分為兩種類型：間接器官發生（器官發生型）：先形成愈傷組織，再由愈傷組織產生不同的器官原基，后形成不同器官。直接器官發生（器官型）：直接從外植體的細胞形成器官原基，然后發育成器官。34第34頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五花直接誘導形成芽愈傷組織分化出不定芽35第35頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五器官發生再生植株的方式：A.先形成芽，芽的基部再產生根；

B.先形成根，根上再出芽；

C.

愈傷組織的不同部位形成芽和根，然后形成微管束組織把兩者結合起來.36第36頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五二、植物組織培養的操作技術1.滅菌與消毒2.培養基的組分與配制3.培養材料的接種4.種質資源的離體保存37第37頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五1.滅菌與消毒

植物材料消毒：常用的消毒劑

玻璃的器皿滅菌

接種工具的滅菌

實驗服、口罩、濾紙滅菌

接種室滅菌

物體表面滅菌

培養室滅菌38第38頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五藥劑滅菌：不同材料，不同滅菌劑其使用濃度、時間與效果不同。干熱：160-180℃,1.5-2.0h濕熱：101.3kpa,121℃,20-40min接種前酒精棉球擦試，并在酒精燈火焰上灼燒滅菌。噴霧、涂抹殺菌紫外燈照射（20-30min）臭氧滅菌機：1-2h熏蒸滅菌：5-8ml/m3甲醛+5g/m3

高錳酸鉀；冰醋酸；1-3%高錳酸鉀或3%來蘇兒。常用滅菌的方法：39第39頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五2.培養基的組分與配制(P173)

培養基種類

固體培養基

液體培養基營養分布均勻，生長整齊一致，但通氣性差。通氣性較好，便于操作，但營養分布不均，生長發育不整齊。40第40頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五培養基成分水無機鹽有機物植物激素支持材料輔助性物質41第41頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五無機鹽大量元素(≥0.5mmol/L)微量元素(≤0.5mmol/L)元素名稱添加形式元素名稱添加形式NKNO3,NH4NO3FeFeNa2-EDTAPKH2PO4,NaH2PO4BH3BO3KKCl,KNO3MnMnSO4CaCaCl2·2H2OCuCuSO4MgMg2SO4·7H2OMoNa2MoO4·2H2OSMg2SO4·

7H2OClCaCl2·2H2O42第42頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五有機物碳水化合物蔗糖（葡萄糖、果糖）維生素天然復合物椰乳香蕉泥馬鈴薯水解酪蛋白其它肌醇（環已六醇）氨基酸43第43頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五維生素硫胺素吡哆醇煙酸生物素泛酸鈣葉酸濃度：0.1－1.0mg/L作用：參與酶的形成,參與植物蛋白質,脂肪的代謝等重要生命活動.44第44頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五氨基酸甘氨酸絲氨酸酪氨酸谷氨酰胺天冬酰氨水解酪蛋白水解乳蛋白45第45頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五生長素類種類：IAA、NAA、IBA、2,4－D作用：誘導愈傷組織和根分化，促進細胞分裂和伸長。濃度：0.05－5mg/L赤霉素類（GA）種類：有20多種，組培中用GA3作用：促莖伸長，促胚發育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入。細胞分裂素類種類：6－BA、KT、ZT等。作用：誘導不定芽分化和莖、苗增殖。濃度：0.05－100mg/L脫落酸（ABA）作用：1）抑制蛋白質的合成；2）抵消和抑制生長素、細胞分裂素、GA的作用；3）誘導休眠、促進衰老與脫落。植物激素46第46頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五培養基支持材料：最常用的是瓊脂，濃度一般為1%左右。輔助性物質：抗生素抗氧化物活性炭

常用種類：青霉素鏈霉素慶大霉素等

用量：5－20%

注意：抗生素對組織生長有抑制作用，使用要慎重.常用半胱氨酸（VC）（50－200mg/L液洗滌外植體傷口表面）作用：具吸附作用；莖尖初代培養可防褐化；促進新梢增殖；促進生根；防止組培苗玻璃化，利于胚胎培養。常用濃度：0.5－10g/L

注意：活性炭具副作用。47第47頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五培養基的PH培養基的PH值，直接影響離子的吸收，過酸過堿對材料的生長都不利。對大多數植物來說，滅菌之前培養基的PH調到5.6—6.0能達到要求。主要用KOH和HCl來調節。一般來說，當PH值高于6時，培養基會變硬，低于5時瓊脂不能很好的凝固。48第48頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五培養基的種類第一類為含鹽量高的基本培養基，如MS、LS、BL、ER。第二類為硝酸鉀含量高的基本培養基，如B5、N6、SH。第三類是無機鹽中等含量培養基，如H基本培養基和尼許（Nitsch）基本培養基。第四類為低鹽含量基本培養基，如White、WS和HE基本培養基。49第49頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五基本培養基的選擇培養基的選擇（1）在選擇一種新的植物材料進行組織培養時，為了盡快建立起再生體系，最好選擇常用的一些培養基，如MS培養基；（2）如果MS培養基不理想，可首先降低它的濃度；（3）其次再選擇在配料成分上與MS有顯著不同的其它培養基加以試用對比。50第50頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五基本培養基的選擇激素濃度和相對比例的確定

在試驗中，首先應參考已有的報道，看是否有用相同的植物、相同的組織或相近者做過成功或失敗的試驗，如果有則可直接作參考；如果沒有，則在建立激素配比中，將每一種擬使用的激素選擇3－5個水平，再按隨機組合的方式建立起如下的實驗方案。培養基的選擇51第51頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五16種激素配比實驗方案生長素濃度（mg/L）細胞分裂素濃度（mg/L）0.51.534.5012340.556781.091011122.01315151652第52頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五體積百分比濃度重量百分比濃度摩爾濃度培養基的配制方法（1）培養基成分的濃度換算53第53頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五大量元素母液的配制微量元素母液的配制

鐵鹽母液配制植物生長調節物質及其

他有機物質母液的配制培養基的配制方法（2）培養基母液的配制

一般配成比所需濃度高10-100倍的母液，用時可按比例稀釋。54第54頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五（3）培養基的配制程序稱瓊脂和蔗糖加熱溶解加水定容加入一定量的各種貯備液調pH分裝滅菌55第55頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五3.培養材料的接種取材滅菌把外植體接種在培養基中污染的預防：嚴格進行無菌操作。極性對培養的影響56第56頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五4.種質資源的離體保存4.1

概述4.2植物種質資源的離體保存常溫限制生長保存低溫保存超低溫保存57第57頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五4.1

概述

4.1.1種質資源的重要作用種質資源(基因庫):是選育新品種的最基本的原始材料。有人說：“人類的命運將取決于人類理解和發覺植物種質資源的能力。”選育新品種時利用的材料單位是性狀，如顏色、高矮、早熟性和抗病性等。選育新品種需要原始材料—已有的栽培品種、半栽培類型和有關野生植物。只要其具有一些能結合到栽培品種上的有用性狀，就都可以作為原始材料。58第58頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五

種質：是親代通過生殖細胞或體細胞傳遞給子代的遺傳物質。4.1.2相關概念植物種質資源：即為攜帶各種不同遺傳物質的植物總稱，又稱遺傳資源或品種資源，包括栽培，野生及人工創造的各種植物的品種或品系。種質資源保存：是指在天然或人工創造的適宜環境條件下，貯存植物種質，使其保持生命力與遺傳性的技術。59第59頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五4.1.3種質資源的保存方式原生境保存：將植物的遺傳材料保存在它們的自然環境中。原生境保存的地方多是植物保護區，另一種方法為農田種植保存。非原生境保存：將植物的遺傳材料保存在不是它們的自然生境的地方。非原生境保存方式有植物園、種質圃、種子(質)庫、試管苗庫、超低溫庫等。具體保存方法有四種：種植保存、貯藏保存、離體保存和基因文庫保存。60第60頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五定義：是指對離體培養的小植株、器官、組織、細胞或原生質體等材料，采用限制、延緩或停止其生長的處理措施使之保存，在需要時可重新恢復其生長，并再生植株的方法。4.2種質資源的離體保存61第61頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五離體保存的意義：可使一些無性繁殖作物種質資源低溫長期保存，避免資源的丟失。節省土地和勞力，方法簡單，花費少并能在保存中脫毒。一旦利用可快速繁殖；也利于種質交換。62第62頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五常溫限制生長保存低溫保存超低溫保存離體保存的方法：63第63頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五4.2.1常溫限制生長保存常溫限制生長保存的概念

正常條件下由于材料生長很快，需經常繼代，增加了工作量及費用，不適合種質資源保存。通過提高滲透壓、添加生長延緩劑或抑制劑、干燥、降低氣壓、改變光照條件等，限制培養物的生長，使轉移繼代的間隔時間延長達到保存種質的方法。64第64頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五4.2.2低溫保存低溫保存的方法和原理低溫保存的概念用離體培養的方式在非凍結程度的低溫下(一般為1-9℃)保存種質的方法。

方法簡單，存活率高.

低溫使植物生長速度受到抑制而減慢，老化程度延緩，因而延長了繼代的時間間隔而達到保存種質的目的.65第65頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五4.2.3超低溫保存種質資源超低溫保存的概念：

植物超低溫種質保存是指將植物的離體材料包括莖尖（芽）、分生組織、胚胎、花粉、愈傷組織、懸浮細胞、原生質體等，經過一定的方法處理后在超低溫（-80～-196℃液氮）條件下進行保存的方法。66第66頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五

在極端低溫溫度下，活細胞內的物質代謝和生長活動幾乎完全停止。因此，細胞、組織和器官在超低溫保存過程中不會產生遺傳性狀的改變，保存了原材料的遺傳特性。同時，由于超低溫條件下，生物的代謝和衰老過程大大減慢，甚至完全停止，因此可以長期保存植物材料。種質資源超低溫保存的原理67第67頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五

在低溫冰凍過程中，細胞內水分結冰會直接破壞細胞結構，造成不可逆性破壞。怎樣才能避免超低溫冷凍保存對細胞造成的破壞呢？68第68頁，共75頁，2023年，2月20日，星期五69措施：①提高植物材料的抗凍能力；②選擇細胞內自由水少的植物材料；③在冷凍和解凍過程中盡量減少冰晶的形成，避免對細胞的損傷。第6