第三章用于基因克隆的載體質粒（plasmid）噬菌體或病毒DNA考斯質粒（cosmid）與噬菌粒人造染色體載體載體的功能及特征3.1載體的功能及特征3.1.1載體的功能運送外源基因高效轉入受體細胞為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件3.1.2載體應具備的條件具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）

具有合適的篩選標記具有較高的外源DNA的載裝能力具有多種單一的核酸內切酶識別切割位點具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點雙螺旋共價閉合環（超螺旋）開環雙螺旋（一個裂口）線狀雙螺旋（兩個裂口）3.2.2

質粒的分子形式3.2.2.1

共價閉合環狀DNA（cccDNA)CovalentclosecircularDNA呈超螺旋（SC）（supercoil）同一質粒盡管分子量相同，不同的構型電泳遷移率不同：scDNA最快、LDNA次之、ocDNA最慢。SCOCL3.2.2.4質粒空間構型與電泳速率3.2.3質粒的自主復制性質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統進行自主復制質粒DNA上的復制子結構決定了質粒與寄主的對應關系根據在每個細胞中的分子數（拷貝數）多寡，質粒可分為兩大復制類型：嚴緊型質粒1-3拷貝stringentplasmid松弛型質粒10-60拷貝stringentplasmid任何兩種含有相似復制子結構的不同質粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現象稱為質粒的不相容性，不相容性的質粒組成不相容性群以大腸桿菌的質粒為例：ColE1、pMB1擁有相似的復制子結構，彼此不相容pSC101、F、RP4擁有相似的復制子結構，彼此不相容p15A及其衍生質粒擁有相似的復制子結構，彼此不相容3.2.4質粒的不相容性3.2.5質粒的可轉移性革蘭氏陰性菌的質粒可分成兩大類：接合型質粒能在天然條件下自發地從一個細胞轉移到另一個細胞，如F、Col、R質粒等非接合型質粒不能在天然條件下獨立地發生接合作用如Col、R的其它成員某些非接合型質粒（ColE1）在接合型質粒的存在和協助下，也能發生DNA轉移，這個過程由bom和mob基因決定。大腸桿菌接合（conjunction）3.2.6攜帶特殊的遺傳標記野生型的質粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質抗性抗生素、重金屬、毒性陰離子、有機物物質合成抗生素、細菌毒素、有機堿這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義3.2.7.1天然質粒的缺陷（1）分子量大，拷貝數低第一個用于基因克隆的天然質粒pSC101，分子長

9.1kb。但只有一個EcoRI切點充當克隆位點，Tetr作為篩選標志。（2）篩選標記不理想ColE1質粒的篩選標志是大腸桿菌素E1（colicinE1）。可以通過插入失活篩選。但細菌群體容易自發突變出抗colicinE1的細胞colicinE1能殺死不含ColE1質粒的菌，形成“噬菌斑”。唯一的克隆位點

EcoRI正好位于這個基因的內部。3.2.7.2質粒的選擇標記及其工作原理：氨芐青霉素抗性（Ampr）卡那霉素抗性

（Kanr）四環素抗性

（Tetr）鏈霉素抗性

（Strr）氯霉素抗性

（Cmlr）絕大多數質粒載體都是用抗菌素抗性標記：i）氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）,青霉素的衍生物。a）抑菌原理，通過干擾細菌細胞壁合成的末端反應，殺死生長的細菌。b）細菌抗性原理：Ampr基因編碼-內酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的-內酰胺環。ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）b）細菌抗性原理：Cmlr

編碼乙酰轉移酶，特異地使氯霉素乙酰化而失活。a）抑菌原理：通過與50S核糖體亞基結合，干擾細胞蛋白質的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細菌。iv）鏈霉素（Streptomycin，Str）a）殺菌原理：通過與30S核糖體亞基結合，導致mRNA錯譯。殺死細菌。b）細菌抗性原理：Strr

編碼一種氨基糖苷磷酸轉移酶對鏈霉素進行修飾，阻斷其與核糖體30S亞基結合作用。v）四環素（Tetracycline，Tet）b）細菌抗性原理：Tetr編碼特異性蛋白質，對細菌的膜結構進行修飾，組止四環素通過細胞膜進入細菌細胞內。a）抑菌原理：通過于30S核糖體亞基結合，干擾細胞蛋白質的合成并阻止肽鍵的形成。殺死生長的細菌。pBR322由F.Bolivar和R.L.Rodriguez人工構建①復制起點

ori：pMB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復制起點②

Ampr基因：pSP2124質粒的Ampr基因③Tetr基因：pSC101的Tetr基因。元件來源4363bp氨芐青霉素和四環素抗性。9個導致Tetr基因失活（如BamHI、HindⅢ）；3個導致Ampr基因失活（ScaI、PvuI、PstI）。24個克隆位點。（2）長度（3）選擇標記（4）克隆位點①雙抗菌素抗性選擇標記：插入失活，分兩次先后選擇：

沒有獲得載體的寄主細胞

在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細胞

在Amp或Tet其中之一中死亡。（5）pBR322的優點外源基因BamHIAmp中存活但在Tet中死亡外源基因PstITet中存活但在Amp中死亡②分子小，克隆能力大：載體越小越好。>10kb的DNA在純化過程中容易斷裂。③高拷貝數：氯霉素擴增之后，每個細胞可達1000~3000copy④安全：失去了轉移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過接合轉移。pBR3224363抗藥性標志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板3.2.8.2pUC18/19：拷貝數2000-3000/cell用于基因克隆和測序裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記lacZ’pBR322的

ori大腸桿菌大腸桿菌lacZ的-肽鏈序列，

是LacZ的氨基端片斷。pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位點。（1）元件來源①復制起點②Ampr基因③lacZ的啟動子④lacZ’基因約2.7kb10個連續的單一限制酶切位點，位于lacZ’基因的5’端。（2）長度（3）克隆位點pUC18/19pUC18/19：正選擇標記lacZ’的顯色原理-半乳糖苷酶能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個深藍色的物質5-溴-4-氯靛藍。Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍-半乳糖苷酶1）-肽（

lacZ’

）：-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片斷（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚體的狀態下才有功能.C端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aaC端大部分N端的11-41aa4聚體2）受體菌lacZ突變（lacZ?M15）受體菌基因組的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚體的活性酶，不能分解Xgal受體菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5apUC質粒載體上的lacZ’

編碼肽與這個缺失突變的-半乳糖苷酶“互補”，使它能形成4聚體。又能分解Xgal。產生藍色物質。C端大部分N端的11-41aapUClacZ’

受體菌lacZ?3）載體lacZ’與互補4）互補的插入失活pUC載體上LacZ’的5‘端有一段多克隆位點(MCS)區，本身雖不干擾LacZ’的合成，但插入外源基因就會阻止LacZ’的合成。不能互補。

lacZ’

5’

3’

肽移碼突變lacZ’

5’

3’

肽不互補互補MCS外源DNA④IPTG的誘導作用IPTG是乳糖的類似物。能誘導lac操縱子的啟動轉錄，使受體菌基因組中的lacZ的C端部分和載體的lacZ’肽都表達。從而互補。IPTGIPTG誘導的結果：①更小的分子量：如pUC18為2682bp，pUC8為2750bp。②選擇方便Xgal顯色、抗菌素雙重直接選擇。③克隆便利具有多克隆位點（MCS）。④測序方便（5）pUC系列載體的優點3.2.8.3.pGEM-3Z由pUC派生而來,與pUC的主要區別是在MCS的兩側分別加了一個噬菌體啟動子T7和SP6。T7啟動子SP6啟動子MCSlacZ’

Amprori可被T7和SP6的RNA聚合酶識別轉錄。①

如果加入純化的T7或SP6RNA聚合酶，在試管里就可以轉錄mRNA②外源基因正接反接都可以轉錄。③

MCS與pUC18的完全一樣。pGEM-3Z的特點：3.2.8.4.PMD18-T3.2.8.5.PMD18-T3.3噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細胞微生物，能高效高特異性地侵染宿主細胞，然后或自主復制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態還會相互轉化。噬菌體或病毒的上述特性使它們的DNA能被開發成為基因工程的有用載體，因為：高效的感染性能使外源基因高效導入受體細胞自主復制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增3.3.1噬菌體的生物學特性：

生物結構λ噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體λ噬菌體由外殼包裝蛋白和λ-DNA組成λ-DNA全長48502個核苷酸λ-DNA上至少有61個基因l噬菌體生物學特性：

生物結構5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l-DNAl噬菌體生物學特性：溶菌周期E.coli吸附LamB受體注入復制包裝裂解l噬菌體生物學特性：溶菌周期體內包裝100個左右的拷貝包裝范圍為原DNA的75-105%即36-51kbDAl噬菌體生物學特性：

溶原狀態l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細胞的染色體DNA上，并不產生子代噬菌體顆粒，這種情況為溶原狀態。DNA重組技術一般需要l噬菌體進入溶菌狀態。噬菌體感染細菌的早期：雙鏈進行型復制。3.3.2DNA的復制

模型（1）

型復制（2）滾環復制

感染的晚期：啟動滾環復制機制。形成多聯體DAN分子。這種多聯體分子必須在cos位點被切斷成單體分子才能被包裝起來。（1）構建原理：3.3.3.噬菌體載體的構建（2）構建過程①在這個非必須區內制造限制酶切點②引進某些突變表型，作為選擇標記③突變某些基因，使它成為安全載體④刪除DNA必須區段上常用的限制酶切點刪除噬菌體的非必需區，留出插入空間。（3）人工構建的噬菌體載體有兩種類型：①插入型載體（insertionvectors)：如

gt10、gt11、BV2、NM540、NM1590、NM6071）免疫功能失活型：插入位點位于載體合成活性阻遏物區域（cI基因）內。EcoRIcIgt10插入導致載體不能合成阻遏物，載體DNA不能進入溶源期，受體菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。沒有外源DNA插入的載體感染受體菌形成混濁噬菌斑。選擇標記:如NM1149載體的兩個克隆位點（EcoRI和HindIII）都是位于cI基因內部。2）-半乳糖苷酶失活型載體：在基因組中引入了LacZ’序列。（其上含有一個EcoRI克隆位點）。感染LacZ突變的大腸桿菌，經IPTG的誘導，利用Xgal的顯色反應作選擇標記。LacZ’

EcoRICharon16A選擇標記:②

替換型載體（substitutionvectors)兩個多克隆位點區以反向重復形式分別位于DNA的非必須區兩端。用酶切后，可以將中間的區段切下來，與用同樣酶切成的外源DNA片斷置換。可置換區MCSMCS如：

EMBL4、Charon40等。1）

EMBL4

EMBL4的可置換片斷內部還有SalI酶切位點。以便于進一步消化中間片斷，防止自我連接。左臂可置換區右臂EcoRIBamHISalISalIBamHIEcoRISalISalIEMBL42）Charon40Charon40的可置換片斷是由DNA短片重復構成，片斷之間有HaeI切點。在克隆的時候，可以用HaeI酶進一步將可置換片斷切成小片斷，以防止重新與載體連接。左臂可置換區右臂MCSMCSCharon40HaeI可取代片斷中如果包含LacZ’，可用Xgal顯色作篩選標記。（4）載體的篩選標記②插入型載體根據插入所引起的表型突變。①置換型載體

DNA象質粒載體那樣直接轉化細菌時效率遠比質粒低。3.3.4載體的體外包裝

在試管中與噬菌體的頭部和尾部蛋白人工裝配成噬菌體顆粒，才能高效地感染細菌，把重組DNA注入受體菌中。（1）體外包裝：

的D基因的產物也是頭部蛋白，但主要與

DNA進入頭部和頭部的成熟有關（只占20%）。（2）體外包裝過程①噬菌體外殼蛋白的合成E基因的E基因編碼頭部蛋白的主要成分（占頭部總蛋白的70%）。D基因E基因突變只合成尾部蛋白和包裝識別蛋白D基因突變合成頭部蛋白和尾部蛋白，但不能聚合和包裝DNA提取尾部蛋白提取頭部和尾部蛋白重組的載體DNA體外包裝成活性噬菌體外源的重組DNA載體被誘發與內源性原DNA發生重組。（3）體外包裝存在的問題：①包裝錯誤：既能包裝用于生產頭部蛋白的內源性原DNA，也能包裝重組的DNA載體。②重組：③體外包裝的容量限制：必須在正常野生型容量的75%—105%（36—51kb）之間。既不能超過正常野生型容量的5%；又不能低于正常野生型容量的75%野生型DNA的必須區是28kb，所以載體的最大克隆容量是23kb。（實際上為15kb）。3.3.5l-DNA作為載體的優點：l-DNA在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉染大腸桿菌

l-DNA載體的裝載能力為25kb，遠大于質粒的裝載量

重組l-DNA分子的篩選較為方便

重組l-DNA分子的提取較為簡便

l-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達外源基因3.4單鏈噬菌體載體

M13、f1、fd噬菌體單鏈環狀DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：M13噬菌體3.4.1M13噬菌體的生物學特性：

生物結構M13噬菌體的外型呈絲狀M13

噬菌體由外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成

M13

DNA全長6407個核苷酸M13DNA上至少有10個基因2700個外殼蛋白分子M13噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制其生長3.4.2M13的生活周期雖然不導致溶菌，但使菌斑混濁（細菌生長變慢，約為正常的1/2—3/4）M13通過雄性細菌的F性須注入其+DNA+DNA合成－DNA，形成RFdsDNA－DNA轉錄mRNA、合成+DNA、翻譯形成噬菌體蛋白組裝成新的噬菌體M13，擠出寄主細胞+DNA-DNAmRNAM13外殼蛋白組裝成子代M13+DNA注入大腸桿菌復制轉錄翻譯+DNA指導合成+DNA200個

RFDNA3.4.3.M13載體的構建：M13基因組中只有基因II與基因IV之間存在一段507bp的基因間隔區。（1）克隆區域的選定①基因間隔區（intergenicregion,IG區）IG區內只有一個

BsuI切點。其余9個BsuI限制性位點分布在其它部位。②酶切位點M13DNA載體的構建：IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列載體lacZ‘polylinkerM13J.Messing證明，IG區存在M13的復制起點，但可以插入外源DNA而不影響M13噬菌體的活力。在IG區內插入一個大腸桿菌的LacZ’（-肽序列)。利用-肽序列中的三個單一酶切位點（BglII、AvaII和

PvuI）。（2）加入酶切位點①

在IG區內加入單一內切酶位點第一個M13載體：M13mp1：M13RFBsuI不完全消化各種長度的線性片斷E.coli

lac基因的HindII片斷(lacI、lacP、lacO、lacZ’）連接M13mp1JM101宿主只有在IG區插入lacZ’才能存活并在Xgal上出現互補的藍噬菌斑3.4.4M13DNA載體的特點：使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細胞外這在DNA定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡便，被M13噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認挑選。而且重組分子越大，混濁斑的混濁度亦越大

但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb3.5考斯質粒與噬菌粒

l-DNA載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為25kb和1.5

kb。包裝上限固定時，縮短噬菌體DNA的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關的序列與質粒組裝在一起，既能縮短載體的長度，同時又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構建考斯質粒和噬菌粒載體的思路。當然，由于考斯質粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細胞內不能形成噬菌體顆粒。3.5.1考斯質粒（cosmid）考斯質粒載體的構建：考斯質粒是一類人工構建的含有l-DNAcos序列和質粒復制子的特殊類型的載體1978年Collins和Hohn發明構建1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段裝載范圍為31-45kbpHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalI考斯質粒載體的特點：能像l-DNA那樣進行體外包裝，并高效轉染受體細胞

裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍能像質粒那樣在受體細胞中自主復制重組操作簡便，篩選容易不能體內包裝，不裂解受體細胞3.5.2噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒載體的特點：噬菌粒是一類人工構建的含有單鏈噬菌體包裝序列、復制子以及質粒復制子、克隆位點、標記基因的特殊類型的載體能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉染受體細胞

裝載量比常規的M13mp系列要大很多（10kb）能像質粒那樣在受體細胞中自主復制重組操作簡便，篩選容易通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈DNA重要的噬菌粒載體：pUC118/119pUC118pUC18+M13間隔區IGpUC119pUC19+M13間隔區IG500個拷貝3200bpMCSlacZ’lacIoriAprM13-MGpUC118/119表示M13輔助噬菌體DNA重要的噬菌粒載體：pBluescript體外轉錄載體pBluescript=pUC+f1-ori+PT3

+PT72958

bpMCSlacZ’PT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌體啟動子PT3和PT7強化外源基因的轉錄提取出來的單鏈DNA重組分子在噬菌體RNA聚合酶的存在下，又可實現外源基因的體外轉錄3.6人造染色體載體

將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區、分配區、穩定區與質粒組裝在一起，即可構成染色體載體。當大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩定的復制并遺傳。目前常用的人造染色體載體包括：細菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（YAC）A.W.Murray1983年形成基礎理論,D.T.Burke等1987年變為現實。3.6.1酵母人工染色體1.YAC的特點：（1）只能在酵母細胞中擴增。（yeastartificialchromosome,YAC)（2）克隆容量大，為230kb-1700kb。（3）構建原理，按染色體結構構建。（1）DNA復制起始點（ori）2.染色體復制和遺傳的三個基本組件：TELTELCENORI（2）著絲粒（centromere，cen）（3）兩個端粒（telomeres，tel）（1）著絲粒區（CEN）AAGTCACGTG

TTGTTTCTGNTTTCCGAAA3.YAC的組成結構酵母染色體著絲粒區的保守序列:78-86bpIIIIII由三個區組成酵母端粒保守序列是(G4T2)n重復序列。（3）復制起點（ORI）約100bp的自主復制序列（ARS）。（2）端粒（TEL）人是TTAGGG重復序列;四膜蟲是GGGTTG重復序列。（真核生物中只有酵母菌有ARS）兩個端粒序列Tel。位于

SUP4

基因內部。（4）克隆位點插入失活選擇：SUP4酶失活的酵母菌落呈紅色；不失活的菌落是白色。TRP1、URA3（分別位于兩臂）。細菌的復制起點

ori和抗生素標記Ampr

（5）在酵母中的標記基因（6）在細菌中操作URA3:尿嘧啶合成缺陷基因

TRP1：色氨基酸缺陷基因YAC載體應含有下列元件：

酵母染色體的端粒序列

酵母人造染色體的構建：pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色體的復制子

酵母染色體的中心粒序列

酵母系統的選擇標記大腸桿菌的復制子

大腸桿菌的選擇標記YAC載體的裝載量為350-400kb酵母人造染色體的使用：pYAC4CENEcoRIURATELBamHITELoriAprTRPARSEcoRIEcoRIEcoRIBamHI連接轉化酵母菌重組酵母染色體著絲粒端粒自主復制因子標記基因標記基因H.Shizuya等在大腸桿菌F因子基礎上構建的。（2）克隆容量可達300kb。3.6.2細菌人工染色體（BAC）1.F質粒的特點：每細胞只有一個拷貝，不會重組。（4）便于提純像提取質粒一樣直接提純。（1）單拷貝復制。（3）比較穩定。3.6.2BAC的組