（優選）病毒性肝炎血清學檢測的基礎與實踐現在是1頁\一共有64頁\編輯于星期四為什么ELISA檢測抗體容易假陽性?抗體的粘附特性，特別是IgM抗體ELISA的高靈敏性抗體結合抗原的適應性：Fab－CDR抗-HIV初篩試驗抗-HIV確診試驗現在是2頁\一共有64頁\編輯于星期四CLVLVHCH1CH2CH3V區Fab段Fc段s-ss-ss-ss-sCDR1CDR3CDR2抗體結構簡圖IgM是五聚體，與抗原具有5或10價結合力。Fab：fragmentantigen-bindingCDR：complementaritydeterminingregionFab段抗體結合抗原的適應性：Fab－CDR現在是3頁\一共有64頁\編輯于星期四抗體產生過程簡圖現在是4頁\一共有64頁\編輯于星期四間接ELISA檢測抗體1.抗原包被2.封閉3.待測血清4.酶標二抗5.TMB顯色6.2MH2SO47.OD450EEEEEE+SubstrateTMB抗-IgG抗-IgA抗-IgMIgGIgAIgM現在是5頁\一共有64頁\編輯于星期四抗體的粘附特性00.501.001.502.00原倍10100100010000血清稀釋倍數OD450間接ELISA，無抗原包被間接法ELISA檢測抗體，靈敏，但容易出現假陽性現在是6頁\一共有64頁\編輯于星期四捕捉法ELISA檢測IgM抗體1.抗mu鏈抗體包被2.封閉3.待測血清4.酶標抗原（特異性）5.TMB顯色6.2MH2SO47.OD450CLVLVHCH1CH2CH3V區s-ss-ss-ss-s敏感性較間接法低，但特異性強現在是7頁\一共有64頁\編輯于星期四ELISA檢測抗原1.抗體包被2.封閉3.待測血清4.酶標抗體5.TMB顯色6.2MH2SO47.OD450EEEEEE+SubstrateTMB包被抗體與酶標抗體識別的免疫表位必須不同現在是8頁\一共有64頁\編輯于星期四病毒性肝炎甲型乙型丙型丁型戊型HepatitisAVirus,HAVHepatitisBVirus,HBVHepatitisCVirus,HCVHepatitisDVirus,HDVHepatitisEVirus,HEV消化道血液消化道感染途徑血液血液病原學病程分型急性急性,慢性急性,慢性急性,慢性急性GBV-C，所謂庚型肝炎病毒，不引起肝損，不是肝炎病毒EB病毒、巨細胞病毒等可引起肝損，但以臟器損傷為主，不稱肝炎病毒現在是9頁\一共有64頁\編輯于星期四病毒性肝炎的病原診斷根據臨床表現無法確定病原診斷依賴實驗室檢查血清學方法：血清+免疫技術檢測抗原或抗體分子生物學：酶免疫測定：enzymeimmunoassay,EIA酶聯免疫吸附測定：enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA分子雜交：同位素或其他物質標記已知DNA或cDNA，即探針，與待測標本中的核酸互補，特異性結合。－－淘汰聚合酶鏈反應：polymerasechainreaction，PCR－－普遍使用現在是10頁\一共有64頁\編輯于星期四甲型肝炎病毒HAV無包膜RNA病毒：抗原種類少正鏈RNA，7.4kbHAV抗原只有一種，即衣殼蛋白；難以測到，不開展特異性抗體：抗-HAVIgG,IgM，保護性抗體；常用HAVRNA：RT-PCR檢測，但陽性率低，僅用于研究現在是11頁\一共有64頁\編輯于星期四024681012抗甲肝抗體濃度感染后周數病毒血癥大便排病毒轉氨酶升高期癥狀期IgMIgGHAV感染后人體抗體應答抗-HAVIgM：感染后～3周即可陽性，1-3月后轉陰，近期或急性感染。抗-HAVIgG：IgM產生后數天即可陽性，存在數十年，單純陽性很可能是既往感染，故單獨檢測抗-HAVIgG通常不用于診斷。現在是12頁\一共有64頁\編輯于星期四甲型肝炎診斷流程同時檢測抗HAVIgM和IgG時：4種情況僅檢測抗-HAVIgM時甲型肝炎抗-HAVIgM陽性抗-HAVIgG陽性甲型肝炎1.2.既往感染，對甲肝有免疫力排除甲肝，而且為易感者抗-HAVIgM陰性抗-HAVIgG陽性抗-HAVIgM陰性抗-HAVIgG陰性3.陽性陰性排除現在是13頁\一共有64頁\編輯于星期四甲型肝炎診斷流程同時檢測抗HAVIgM和IgG時：4種情況甲型肝炎早期或IgM假陽性1-2周后復查甲型肝炎甲型肝炎IgM假陽性排除甲型肝炎抗-HAVIgM陽性抗-HAVIgG陰性IgM陽性IgG陽性IgM陰性IgG陽性IgM陽性IgG陰性4.現在是14頁\一共有64頁\編輯于星期四乙型肝炎病毒HBV顆粒完整HBV：

Daneparticle；球形，42nm，雙層殼膜結構小球形顆粒：22nm，乙肝表面抗原（hepatitisBsurfaceantigen,HBsAg）絲狀(管狀)顆粒：直徑22nm，長短不等，HBsAg18.7萬倍20萬倍25萬倍HBV雙層殼膜結構，外層是HBsAg，內層是HBcAg現在是15頁\一共有64頁\編輯于星期四HBV基因與基因產物pre-S1pre-S2ORFSORFPORFXORFCpre-C+-5’5’HBsAgPolymerase:DNApolymeraseRNaseHReversetranscriptaseothers

HBxAgHBcAgHBeAgpre-S1pre-S2現在是16頁\一共有64頁\編輯于星期四HBV主要結構示意圖HBsAgHBcAgHBVDNAHBeAg不是病毒的結構成份現在是17頁\一共有64頁\編輯于星期四HBVPreC/C基因序列1814atgcaactttttcacctctgcctaatcatctcttgttcatgtcctac1861tgttcaagcctccaagctgtgccttggggggctttgggacatggacattg1911accactataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgcct1961tttgacttctttccttctattcgagatctcctcgacaccgcctctgctct2011ctatcgagaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacag2061cactcaggcaagctgttctgtgttggggtgagttgatgaatctggccacc2111tgggtgggaagtaatttggaagacccagcatccagggaattagtagtcgg2161ctatgtcaatgttaatatgggcctaaaaatcagacaactattggggtttc2211acatttcctgtcttacttttggaagagaaactgttctagagtatttggtg2261tcttttggagtgtggattcgcactcctcccgcttacagaccaccaaatgc2311ccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttagacgacgaggca2361ggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcg2411ccgcgtcgcagaagatctaaatctcgggaatctcaatgttag現在是18頁\一共有64頁\編輯于星期四MQLFHLCLIISCSCPTVQASKLCLGGLWDM

DIDHYKEFGASVELLSFLPFDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAVLCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVGYVNVNMGLKIRQLLGFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSKSRESQC147-149HBVPreC/C編碼HBcAg/HBeAgHBcAg:21.5kDHBeAg:15.5kD現在是19頁\一共有64頁\編輯于星期四HBV抗原5’3’5’3’42nmHBsAgHBcAgHBVDNAHBeAg不是HBV本身的成分是HBcAg的裂解產物能釋放到細胞外外周血能測到能釋放到細胞外外周血能測到不能釋放到細胞外外周血不能測到外周血無游離HBVDNA檢測時先裂解HBVHBV示意圖現在是20頁\一共有64頁\編輯于星期四HBV抗原5’3’5’3’42nmHBsAgHBcAgHBVDNAHBeAg不是HBV本身的成分是HBcAg的裂解產物能釋放到細胞外外周血能測到能釋放到細胞外外周血能測到不能釋放到細胞外外周血不能測到外周血無游離HBVDNA檢測時先裂解HBVHBV示意圖現在是21頁\一共有64頁\編輯于星期四HBV攜帶者肝臟每天釋放1010~12病毒血液HBsAg是HBV的1000~100000倍HBV編碼抗原特點現在是22頁\一共有64頁\編輯于星期四HBsAg抗-HBsHBsAg+，有傳染性HBsAg+和HBeAg+，傳染性強HBsAg-，無傳染性，除隱匿性感染或變異外抗-HBs+，>10mIU/ml，有保護力HBeAg抗-HBe抗-HBc乙型肝炎病原學檢測HBVDNA有條件的開展抗病毒治療考核療效現在是23頁\一共有64頁\編輯于星期四乙肝血清學檢測結果的意義HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc臨床意義+-+-+感染、傳染性強+--++感染、有傳染性+--+-感染、有傳染性+---+感染、有傳染性+-+--感染、傳染性強+++/-+/-+/-感染、有傳染性、病毒可能變異+----感染潛伏期、有傳染性+----接種疫苗后、無傳染性現在是24頁\一共有64頁\編輯于星期四HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc臨床意義-+-++既往感染已恢復、有保護力-+--+既往感染已恢復、有保護力-+-+-既往感染已恢復、有保護力-+---接種疫苗或既往感染已恢復、有保護力---++既往感染已恢復、無保護力---+-既往感染已恢復、無保護力----+既往感染已恢復、無保護力-----既往無感染、易感人群乙肝血清學檢測結果的意義現在是25頁\一共有64頁\編輯于星期四為什么可通過檢測外周血抗原診斷HBV感染？HBeAg能釋放到細胞外－－比較容易測到HBsAg能釋放到細胞外－－可測到HBV攜帶者肝臟每天釋放1010~12病毒血液HBsAg是HBV的1000~100000倍其他病毒復制過程中，缺乏類似特性，不釋放游離抗原，故通常不檢測抗原，而通過檢測特異性抗體而診斷。以上原因，決定了診斷HBV感染可通過檢測病毒抗原。容易測到現在是26頁\一共有64頁\編輯于星期四抗-HBc的意義抗-HBcIgG：長期存在，陽性時如HBsAg陰性，既往感染抗-HBcIgM：短期存在，陽性時，通常HBsAg也陽性；見于急性感染或慢性攜帶者急性發作實際工作中，抗-HBc陽性具有傳染性－－基本不正確－－抗-HBcIgM具有傳染性－－正確目前檢測的抗-HBc是總抗體，包括IgG、IgM等，只要IgG陽性，抗-HBc即陽性；多數情況下，抗-HBc陽性僅是IgG抗體陽性。正確－－HBsAg陽性具有傳染性現在是27頁\一共有64頁\編輯于星期四HBsAg(－)HBeAg(+)陽性HBV攜帶者March2008October2008January2009HBsAg(IU/ml)--(0.01)-(0.00)抗-HBs(mIU/ml)++

(5356)+

(11578)

HBeAg++

(72.78)+

(72.89)抗-HBe--(4.33)-(4.28)抗-HBc++

(11.89)+

(15.91)抗-HBcIgMnotdone--ALT(U/L)21.024.221.5HBVDNA(copies/ml)notdone+

(491)+

(370)現在是28頁\一共有64頁\編輯于星期四HBsAg(－)HBeAg(+)陽性攜帶者新的S基因變異PCR產物測序克隆后測序現在是29頁\一共有64頁\編輯于星期四preS2geneHBsAg(－)HBeAg(+)陽性攜帶者前S2基因序列PCR產物測序克隆后測序現在是30頁\一共有64頁\編輯于星期四HBsAg(－)HBeAg(+)陽性HBV攜帶者IF3.124現在是31頁\一共有64頁\編輯于星期四具有研究價值的HBV標本HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe抗-HBc研究內容+++/-+/-+/-變異+----轉歸+-+--轉歸+--+-？抗c陰性-+-+-？抗c陰性-+---？抗c陰性*---+-？抗c陰性*未接種疫苗，即自然感染除外。現在是32頁\一共有64頁\編輯于星期四丙型肝炎病毒HCVHCV30-60nm有包膜的RNA病毒，核心含有核心蛋白和RNA－－單鏈正義HBVHCV抵抗力弱，且RNA容易降解，檢測核酸時，標本需在30分鐘內分離血清，-80oC保存。現在是33頁\一共有64頁\編輯于星期四Lipidlayer脂質層Core,核心蛋白E1,包膜蛋白1E2,包膜蛋白2RNA,病毒核酸直徑30-60nm結構蛋白HCV結構簡圖糖基化蛋白HCV示意圖現在是34頁\一共有64頁\編輯于星期四HCV基因與基因產物hypervariableregion1,HVR1UntranslatedRegion,UTRNoncodingregion,NCR針對HCV所有抗原的抗體都沒有證實有中和作用現在是35頁\一共有64頁\編輯于星期四HVR138clones15sequencesHCV高度變異HVR1現在是36頁\一共有64頁\編輯于星期四抗原檢測HCVcore:僅用于研究抗-HCVIgM：一般不開展，陽性率低HCVRNA：有條件的開展；抗病毒治療考核療效抗-HCVIgG：開展，(+)通常表示有HCV感染HCV病原學診斷針對HCV所有抗原的抗體都沒有證實有中和作用現在是37頁\一共有64頁\編輯于星期四抗-HCVIgM：一般不開展抗-HCVIgG：開展，90-95％的(+)提示HCV感染HCV病原學診斷－－抗-HCV檢測包被抗原1st代3rd代2nd代50-75%90-95%95-99%陽性率現在是38頁\一共有64頁\編輯于星期四丁型肝炎病毒HDVDeltavirusgenus中的唯一病毒HDV,36nmHDVRNA,1.7kb缺陷病毒，必須有HBsAg現在是39頁\一共有64頁\編輯于星期四HDAg：僅用于研究抗-HDIgM：(＋)近期感染抗-HDIgG：(＋)感染HDVRNA：僅用于研究HDV病原學檢測僅在HBsAg陽性人群中檢測才有意義：現在是40頁\一共有64頁\編輯于星期四戊型肝炎病毒HEV屬于familyHepeviridae,genusHepevirusHEV,30-32nm無包膜：抗原種類少新的HEV發現：兔HEV－－王佑春等現在是41頁\一共有64頁\編輯于星期四HEV基因及其蛋白ORF1ORF3？ORF25’3’核衣殼Capsid非結構蛋白結構蛋白主要抗原決定簇中和免疫459607核酸：單鏈正義RNA，7.2kb現在是42頁\一共有64頁\編輯于星期四02468101214轉氨酶升高期癥狀期IgMIgG病毒血癥大便排病毒抗戊肝抗體濃度感染后周數HEV感染后人體抗體應答－－與HAV類似抗-HEVIgM：感染后～3周即可陽性，1-3月后轉陰，近期或急性感染。抗-HEVIgG：IgM產生后數天即可陽性，存在數十年，單純陽性很可能是既往感染，故單獨檢測抗-HAVIgG通常不用于診斷。現在是43頁\一共有64頁\編輯于星期四HEV抗原：一般不開展，僅用于研究HEV病原學檢測－－與甲肝類似抗-HEVIgM：(＋)近期感染抗-HEVIgG：雙份血清HEVRNA：一般不開展，僅用于研究現在是44頁\一共有64頁\編輯于星期四HEV病原診斷－－抗-HEV同時檢測抗HAVIgM和IgG時：4種情況僅檢測抗-HEVIgM時戊型肝炎抗-HEVIgM陽性抗-HEVIgG陽性戊型肝炎1.2.既往感染，對戊肝有免疫力排除戊肝，而且為易感者抗-HEVIgM陰性抗-HEVIgG陽性抗-HEVIgM陰性抗-HEVIgG陰性3.陽性陰性排除現在是45頁\一共有64頁\編輯于星期四同時檢測抗HAVIgM和IgG時：4種情況戊型肝炎早期或IgM假陽性1-2周后復查戊型肝炎戊型肝炎IgM假陽性排除戊型肝炎抗-HEVIgM陽性抗-HEVIgG陰性IgM陽性IgG陽性IgM陰性IgG陽性IgM陽性IgG陰性4.HEV病原診斷－－抗-HEV現在是46頁\一共有64頁\編輯于星期四抗-HEV檢測試劑質量差異很大(國外)方法種類抗原ORF來源病毒+血<6月9例+血>6月20例-血清22例1EIAR2昆蟲巴基91802EIAR2昆蟲緬甸92003WBR2昆蟲緬甸9201[6]4WBR2,3大腸中國8190[1]5EIAR2大腸緬甸91906EIAR2,3大腸緬,墨51407EIAR2,3大腸緬,墨91708EIAR2,3大腸緬,墨614[1]09EIAS3－緬甸115[2]10EIAS2－緬甸7[1]3[6]011EIAS3－緬,墨22012EIAS2,3－緬,墨6100Hepatology1998;27:857-861.現在是47頁\一共有64頁\編輯于星期四12種檢測方法早期康復期血清抗-HEV滴度Hepatology1998;27:857-861.WBWB昆蟲大腸桿菌合成肽現在是48頁\一共有64頁\編輯于星期四抗-HEVIgG診斷試劑陽性率比較(國內外)廠商結果明確人群(符合率%)總符合率%230例普通人群(%)患者24例非患者30例萬泰+23(95.83)1(3.33)96.3073(31.74)-1(4.17)29(96.67)高達+21(87.50)094.4440(17.39)-3(12.50)30(100)華美+21(87.50)1(3.33)92.5955(23.91)-3(12.5)29(96.67)GeneLab+16(66.67)085.1818(7.83)-8(33.33)30(100)科華+11(45.83)075.938(3.48)-13(54.17)30(100)不同試劑檢測結果偏差很大，尤其在血清流行病學調查。中華實驗和臨床病毒學雜志2007;21(1):59-61.現在是49頁\一共有64頁\編輯于星期四抗-HEVIgM抗-HEVIgG檢測方法存在一定假陽性和假陰性現在是50頁\一共有64頁\編輯于星期四607-660ORF21-111458-607ORF3-EORF3-S112391123ORF36601主要抗原決定簇GeneLabs試劑的抗原，間接法JVirolMethods1992;38(1):175–86.包被抗原ORF2ORF31和2型、合成肽和細菌表達靈敏度和特異性低現在是51頁\一共有64頁\編輯于星期四ORF2衣殼蛋白，72kDa國產抗-HEV試劑盒所用抗原萬泰公司抗原：IgM，包被mu鏈，酶標抗原IgG，包被抗原，酶標二抗3946061660特異性高靈敏度較高458-607高達試劑：合成肽？同時包括了ORF2和ORF3多肽抗原，具體不詳？首都公共衛生2007;1(4):168-170.華美公司和科華公司：現在是52頁\一共有64頁\編輯于星期四靈長動物實驗感染后抗-HEVIgM和IgG應答Yu,etal.CGLI2003現在是53頁\一共有64頁\編輯于星期四急性戊肝病人抗-HEVIgM和IgG應答Seriwatana,etal.CGLI2002現在是54頁\一共有64頁\編輯于星期四如何提高戊型肝炎診斷的準確性？急性HEV感染，發病時抗-HEVIgM和IgG通常同時陽性確診同時檢測抗-HEVIgG和IgMIgG＋IgM＋IgG－IgM＋IgG＋IgM－IgG－IgM－1－2周后復查排除既往感染IgG＋IgM＋IgG－IgM＋IgG－IgM－確診假陽性假陽性現在是55頁\一共有64頁\編輯于星期四Ch1374(Sar-55,I)A450Ch1375(Sar-55,1)458-6071660112-6070.00.53.03.50246810131517112-607458-607475-607475-607Ch1374(Sar-55,1)感染后周數感染后周數0.00.51.01.52.02.53.03.50246810131517112-607458-607475-607A4501.01.52.02.5利用抗原主要決定簇多肽的高反應性檢測陽性標本利用抗原主要決定簇截短肽的無反應性排除假陽性如何提高戊型肝炎診斷的準確性？現在是56頁\一共有64頁\編輯于星期四表達載體HEVORF21660459459607594ORF2多肽的蛋白表達472607將重組質粒導入大腸桿菌現在是57頁\一共有64頁\編輯于星期四123123123459-607459-594472-607kDa362216ORF2多肽大腸桿菌表達ORF2多肽SDS電泳結果現在是58頁\一共有64頁\編輯于星期四459-607459-594472-607459-607459-594472-607kDa36221650二聚體單體SDS加樣緩沖液煮沸5min