臨床細菌學檢驗概述

IntroductiononClinicandDiagnosticBacteriology學系病原周天戟教授4/7/20231本章內容第一節標本的采集和處理原則第二節細菌的形態學檢查第三節細菌的分離培養和鑒定第四節細菌的非培養檢測方法4/7/20232第一節標本的采集和處理原則一、標本采集的一般原則1．早期采集2．無菌操作3．根據目的菌的特性用不同的方法采集4．采集量適當5．注意生物安全

4/7/20233５.病人標本中可能含有大量致病菌，必須注意安全防護６.標本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必須包裝好，防止送檢過程中倒翻或碰破流出７.對于烈性傳染病標本運送時更要特別嚴格，必須按規定包裝，由專人運送８.厭氧性標本應放在專門的運送瓶或試管內運送，有時可直接用抽取標本的注射器運送4/7/20235藥物敏感試驗標本直接涂片鏡檢分離培養形態學試驗生化試驗免疫學試驗動物試驗明確診斷初步診斷免疫學試驗分子生物學技術其他檢測技術細菌感染的檢驗程序輔助診斷4/7/20236第二節細菌的形態學檢查1.鏡檢可以了解有無細菌及大致的菌量2.通過形態學檢查可得到初步診斷，對臨床早期診斷和治療疾病有一定的參考意義3.根據細菌形態、結構和染色性有助于對病原菌的初步識別和分類，用于細菌鑒定細菌形態學檢查的意義4/7/20237一、不染色標本1.細菌不經染色直接鏡檢，主要用于檢查生活狀態下細菌的動力及運動狀況2.常用的方法有壓滴法和懸滴法有動力：可看到細菌自一處移至另一處，有明顯的方向性位移無動力：細菌呈現布朗運動，只在原地顫動而無位置的改變3.有些病原菌通過不染色標本的動力檢查可作出初步鑒定如疑似霍亂患者，鏡下觀察到來回穿梭似流星狀運動的細菌，制動試驗陽性，可初步推斷為“疑似O1群霍亂弧菌”。4/7/20239二、染色標本（一）常用染料1．堿性染料：堿性復紅、結晶紫、美藍等2．酸性染料：有伊紅、剛果紅等3．復合染料（中性染料）及熒光染料：復合染料有瑞氏染料（伊紅美藍）、姬姆薩染料（伊紅天青）等；熒光染料有熒光標記的抗體

4/7/202310（二）常用的染色方法1．革蘭染色（gramstain）方法：1、結晶紫初染1min2、盧戈氏碘液媒染1min3、95％酒精脫色30sec～1min4、稀釋石炭酸復紅復染1min原理：G+等電點低，帶正電荷的堿性燃料作色牢固G+細胞壁肽聚糖層多，G-細胞壁脂質含量高G+含有較多核糖核酸鎂鹽，與結晶紫、碘結合成大分子復合物意義：鑒定細菌與致病性有關選擇抗菌藥物參考革蘭陰性桿菌革蘭陽性球菌4/7/202311（二）常用的染色方法3．熒光染色（1）熒光染色法敏感性強，效率高而且容易觀察結果，在臨床細菌鑒定中有很大的實用價值。（2）主要用于結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、白喉棒狀桿菌及痢疾志賀菌等的檢測。4.鞭毛染色：可觀察到菌體上有無鞭毛、鞭毛的位置及數量，在細菌鑒定中，特別是非發酵菌的鑒定中很重要。5.異染顆粒染色：用于白喉棒狀桿菌染色。4/7/202313（二）常用的染色方法6.芽胞染色：7.墨汁染色:一般用于新型隱球菌檢查4/7/202314第三節細菌的分離培養和鑒定選擇培養基接種選擇培養方法選擇可疑菌落選擇鑒定方法4/7/202315一、培養基的種類和選擇培養基（culturemedium）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養物制品。

4/7/202317(一)培養基的組成成分1．營養物質蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖類、醇類、血液、無機鹽類、雞蛋和動物血清生長因子2．凝固物質瓊脂、明膠、卵白3．抑制劑和指示劑4/7/202318（二）培養基種類---按成分和培養目的1．基礎培養基（basedmedium）2．營養培養基（nutrientmedium）3．鑒別培養基（differentialmedium）4．選擇培養基（selectivemedium）5．特殊培養基（specialmedium）4/7/2023192．營養培養基（nutrientmedium）最常用的是血瓊脂平板、巧克力血平板等，用于培養營養要求較高的病原性細菌4/7/2023213．鑒別培養基（differentialmedium）在培養基中加入特定底物和指示劑，觀察細菌不同的代謝產物，以鑒別細菌。如糖發酵管、克氏雙糖鐵瓊脂（KIA）、伊紅-鎂藍瓊脂和動力-吲哚-尿素（MIU）培養基等。4/7/2023224．選擇培養基（selectivemedium）在培養基中加入抑制劑抑制雜菌，以利目的細菌生長，如SS瓊脂使致病的沙門菌、志賀菌容易分離到4/7/202323（二）培養基種類---按物理性狀液體培養基：增菌、制備產物、生化反應等固體培養基:

瓊脂平板:分離培養

瓊脂斜面:菌種短期保存、生化反應等半固體培養基:動力試驗、菌種長期保存、生化反應等4/7/202325（三）培養基的選擇目的病原菌：伊紅美藍/麥康凱用于篩選革蘭陰性桿菌，血平板用于分離病原性球菌。標本來源：從血液、骨髓中分離病原菌先用血液肉湯增菌，糞便標本分離培養腸道病原菌用SS瓊脂，4/7/202326固體培養基中菌落（S型）菌苔菌落（R型）細菌的生長情況4/7/202329沉淀生長混濁生長表面生長液體培養基中4/7/202330混濁生長沿穿刺線生長生長有鞭毛細菌無鞭毛細菌半固體體培養基中4/7/202331三、生化反應和鑒定（一）碳水化合物的代謝試驗1.糖（醇、苷）類發酵試驗是鑒定細菌最主要和最基本的試驗，特別對腸桿菌科細菌的鑒定尤為重要4/7/202332氧化型發酵型產堿型2．氧化―發酵試驗（O/F試驗）主要用于腸桿菌科細菌與非發酵菌的鑒別，前者均為發酵型，而后者通常為氧化型或產堿型。也可用于葡萄球菌與微球菌間的鑒別。4/7/2023333．β―半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）迅速及遲緩分解乳糖的細菌ONPG試驗為陽性，而不發酵乳糖的細菌為陰性。本試驗主要用于遲緩發酵乳糖菌株的快速鑒定。4/7/202334三、生化反應和鑒定4．七葉苷水解試驗主要用于D群鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。5．甲基紅試驗主要用于鑒別大腸埃希菌與產氣腸桿菌。6．V―P試驗本試驗常與甲基紅試驗一起使用，因為前者陽性的細菌，后者通常為陰性。4/7/202335（二）蛋白質和氨基酸的代謝試驗2．吲哚(靛基質)試驗主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。1.明膠液化試驗主要用于腸桿菌科細菌的鑒別。3．硫化氫試驗培養基：醋酸鉛培養基應用：主要用于腸桿菌科中屬及種鑒別4/7/202336三、生化反應和鑒定4．尿素分解試驗主要用于腸桿菌科中變形桿菌屬細菌的鑒定。5．苯丙氨酸脫氨酶試驗主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅菲登斯菌屬和摩根菌屬細菌均為陽性，腸桿菌科中其他細菌均為陰性。6．氨基酸脫羧酶試驗主要用于腸桿菌科細菌的鑒定。4/7/202337（三）碳源和氮源利用試驗1．枸櫞酸鹽利用試驗用于腸桿菌科中菌屬間的鑒定。2．丙二酸鹽利用試驗腸桿菌科中屬間及種的鑒別。4/7/202338（四）各種酶類試驗1．氧化酶試驗主要用于腸桿菌科細菌與假單胞菌的鑒別。2．過氧化氫酶試驗（觸酶試驗）用于革蘭陽性球菌的初步分群。4/7/2023393．硝酸鹽還原試驗本試驗在細菌鑒定中廣泛應用。腸桿菌科細菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；銅綠假單胞菌、嗜麥芽假單胞菌等假單胞菌可產生氮氣；有些厭氧菌如韋榮球菌等試驗也為陽性。4/7/202340三、生化反應和鑒定4．脂酶試驗主要用于厭氧菌的鑒別。5．卵磷脂酶試驗主要用于厭氧菌的鑒定。6．DNA酶試驗在革蘭陽性球菌中只有金黃色葡萄球菌產生DNA酶，在腸桿菌科中沙雷氏菌和變形桿菌產生此酶。4/7/202341三、生化反應和鑒定8．CAMP試驗在鏈球菌中，只有B群鏈球菌CAMP試驗陽性，故可作為特異性鑒定。7．凝固酶試驗作為鑒定葡萄球菌致病性的重要指標，也是葡萄球菌鑒別時常用的一個試驗。4/7/202342（五）抑菌試驗1．O/129抑菌試驗用于弧菌科的屬間鑒別，弧菌屬、鄰單胞菌屬對O/129敏感，而氣單胞菌屬耐藥。2．桿菌肽試驗用于A群鏈球菌與非A群鏈球群的鑒別。3．奧普托欣（Optochin）試驗主要用于肺炎鏈球菌與其他鏈球菌的鑒別。4/7/202343第四節細菌的非培養檢測方法一、免疫學技術抗原檢測、抗體檢測二、分子生物學技術核酸雜交、聚合酶鏈反應、生物芯片技術三、細菌毒素的檢測內毒素、外毒素四、動物實驗

4/7/202344一、免疫學技術概念辨析免疫學檢測免疫學診斷免疫學反應免疫學技術血清學檢測血清學反應血清學技術血清學診斷抗原不區分抗體4/7/202345（一）細菌Ag檢測菌體Ag：IFA、熒光菌球法、凝集試驗游離Ag：ELISA免疫熒光技術是利用免疫學特異性反應與熒光示蹤技術相結合的顯微鏡檢查手段。既保持了血清學的高特異性，又極大地提高了檢測的敏感性，在細菌鑒定方面占有重要地位。常用的方法有直接法、間接法和免疫熒光菌球法。血清學試驗的對照設計+/—/0？4/7/202346（二）抗體檢測---血清學診斷抗體的量常隨感染過程而增多，表現為效價的升高。因此用已知的細菌或其特異性抗原檢測病人血清中有無相應抗體及其效價的動態變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。主要適用于抗原性較強的致病菌和病程較長的感染性疾病。4/7/202347標本：雙份血清標本，恢復期比急性期血清標本抗體效價升高≥4倍方有意義方法原理：用已知的細菌或其特異性抗原檢測患者體液中相應特異性抗體和其效價的動態變化，可作為某些傳染病的輔助診斷。凝集試驗：沉淀試驗：補體結合試驗：中和試驗：肥達試驗、外斐試驗梅毒VDRL、RPR試驗等抗鏈“O”試驗等Q熱柯克斯體抗體檢測等細菌的血清學診斷4/7/202348二、分子生物學技術（一）核酸雜交DNA可進行變性、復性、雜交。利用這一特性，制備特定序列DNA片段，進行標記后用作探針，在一定條件下，按照堿基互補配對原則與標本中已變性的細菌DNA進行雜交，通過檢測雜交信號確定是否發生雜交反應，從而鑒定標本中有無相應的病原菌基因。探針的種類：克隆片段DNA探針、寡核苷酸針、質粒DNA探針、rRNA探針、4/7/202349（一）核酸雜交2．核酸雜交在臨床細菌檢測中的應用（1）細菌分類鑒定（2）細菌快速鑒定（3）細菌耐藥性的檢測（4）細菌毒素的檢測（5）細菌流行病學調查4/7/202350（二）聚合酶鏈反應

（polymerasechainreaction,PCR）1.特異性DNA體外擴增技術2.特異、靈敏、快速、操作簡便3.廣泛應用于細菌的鑒定PCR在臨床細菌檢測中的應用1.細菌的快速檢測2.細菌毒素的檢測3.細菌耐藥性的檢測4.細菌流行病學調查4/7/202351（三）生物芯片技術1.通過微加工技術和微電子技術在固體芯片表面構建微型生物化學分析系統。2.對細胞、蛋白質、DNA以及其他生物組的準確、快速、大信息量的檢測。3.常用的生物芯片分為二大類：即基因芯片和蛋白芯片。4/7/202352三、細菌毒素的檢測（一）內毒素內毒素的測定，主要用于確診病人是否發生革蘭陰性細菌感染。另外，還可用于檢測注射用液和生物制品有無內毒素污染。方法：鱟試驗。4/7/202353三、細菌毒素的檢測（二）外毒素外毒素的測定可用于待檢菌的鑒定，同時可區分產毒株與非產毒株。方法：1.體內毒力試驗：動物試驗，如破傷風毒素試驗2.體外毒力試驗：Ag-Ab反應，如ELEK平板毒力測定4/7/202354其他成分檢測酶試驗：脲酶(HP)、血漿凝固酶試驗(葡萄球菌)、自溶酶(肺炎球菌)等毒素檢測：溶血毒素(β鏈球菌)、腸毒素(葡萄球菌)、神經毒素(肉毒桿菌)等特殊成分檢測：真菌多糖，細菌LPS、胞壁酸、吡啶二羧酸(DAP芽抱)、分枝菌酸（分枝桿菌屬