RNA指導的DNA復制逆轉錄及病毒的復制當前1頁，總共42頁。逆轉錄酶（reversetranscription)

1964年，Temin發現Rous肉瘤病毒等RNA病毒所造成的感染可被DNA合成抑制劑遏制。表明：RNA腫瘤病毒的RNA復制過程中要合成DNA。Temin又發現放線菌素D能抑制致癌RNA病毒的復制，但不能抑制一般RNA病毒的復制。表明：轉錄對于RNA病毒增殖是必需的。當前2頁，總共42頁。Temin提出前病毒假說：原病毒DNA是RNA腫瘤病毒在復制和致癌中的中間物。1970年，Temin在Rouse肉瘤病毒、Baltimore在白血病病毒中發現逆轉錄酶。當前3頁，總共42頁。多功能酶：

1、RNA指導的DNA聚合酶活性2、RNA酶H（RNaseH）活性：水解RNA-DNA雜交體上的RNA3、DNA指導的DNA聚合酶活性：合成互補DNA。4、沒有3`→5`外切酶活性。當前4頁，總共42頁。特點：

含有Zn2+（是否有鋅指結構、DNA結合功能？）DNA合成反應要求有模板和引物。需適當濃度的二價陽離子（Mg2+、Mn2+）5’→3’合成方向→當前5頁，總共42頁。逆轉錄病毒的基因

組復制過程第一階段：合成負股cDNA的大部分第二階段：以負股DNA為模板合成一小部分正股DNA鏈。第三階段：完成cDNA的全部復制。當前6頁，總共42頁。當前7頁，總共42頁。當前8頁，總共42頁。當前9頁，總共42頁。乙肝病毒基因組的復制其復制需通過逆轉錄過程經RNA中間體實現，其DNA聚合酶也是一種逆轉錄酶。當前10頁，總共42頁。當前11頁，總共42頁。逆轉錄病毒：RNA→DNA→RNA乙肝病毒：DNA→RNA→DNA當前12頁，總共42頁。試管內cDNA的合成常用于獲得或研究真核生物基因的方法。提取某一種特定的mRNA，經逆轉錄生成的cDNA可代表某一特定基因。常用的逆轉錄酶有兩種：來自鳥類成髓細胞瘤逆轉錄病毒稱為AMV-RT；來自鼠白血病毒稱為MMLV-RT。當前13頁，總共42頁。當前14頁，總共42頁。病毒RNA復制的主要方式1、病毒含有正鏈RNA，如灰質炎病毒。RNA（+）→蛋白質（酶）→RNA復制2、病毒含有負鏈RNA和復制酶如狂犬病毒。RNA（-）→RNA（+）→蛋白質、復制病毒RNA（-）。3、病毒含有雙鏈RNA和復制酶。如呼腸孤病毒。雙鏈RNA→RNA（+）→蛋白質→RNA（-）→雙鏈RNA4、逆轉錄病毒。當前15頁，總共42頁。討論題如何知道DNA復制中先要有RNA引物的合成？(原料/新合成DNA序列分析/專一核酸酶水解)當前16頁，總共42頁。病毒的復制

病毒在活細胞內，以其基因為模板，在酶的作用下，分別合成病毒基因及蛋白質，再組裝成完整的病毒顆粒，這種方式稱為復制（replication)。從病毒進入宿主細胞開始，經過基因組復制和病毒蛋白合成，至釋放出子代病毒的全過程，稱為一個復制周期。病毒的復制周期主要包括吸附和穿入、脫殼、生物合成、組裝和釋放四個連續步驟。當前17頁，總共42頁。復制周期當前18頁，總共42頁。病毒的一步生長曲線病毒的一步生長曲線：以感染時間為橫坐標，病毒效價為縱坐標，繪制出的病毒特征曲線。當前19頁，總共42頁。一、吸附和穿入（一）吸附(adsorption)分兩個階段：靜電吸附：病毒體與細胞接觸，進行靜電結合。非特異性、可逆。真正的吸附：病毒體表面位點（蛋白質結構）與宿主細胞膜上相應的受體結合。是決定病毒感染的真正開始。當前20頁，總共42頁。裸露病毒的吸附

當前21頁，總共42頁。囊膜病毒的吸附

當前22頁，總共42頁。（二）穿入(penetration)

病毒體吸附在宿主細胞膜上后，可通過數種穿入方式進入細胞：1.無囊膜的病毒

一般經過細胞膜吞入，稱為病毒胞飲,如腺病毒、小RNA病毒等當前23頁，總共42頁。病毒胞飲當前24頁，總共42頁。2.有囊膜的病毒囊膜與宿主細胞膜融合，病毒的核衣殼直接進入細胞漿內病毒胞飲:細胞膜吞入當前25頁，總共42頁。(1)膜融合后進入當前26頁，總共42頁。(2)

病毒胞飲當前27頁，總共42頁。二、脫殼(uncoating)

不同病毒脫殼方式不一，多數在宿主細胞溶酶體酶作用下脫殼，釋放出基因組核酸。當前28頁，總共42頁。三、生物合成(biosynthesis)病毒基因組一旦從衣殼中釋放后，就利用宿主細胞提供的低分子物質合成大量的病毒核酸和結構蛋白。早期，根據病毒基因組轉錄成mRNA、指令合成轉錄合成所必需的復制酶和一些抑制蛋白；生物合成階段，病毒處于隱蔽期病毒的生物合成過程可基本歸為6大類：雙股DNA病毒、單股DNA病毒、單正股RNA病毒、單負股RNA病毒、逆轉錄病毒和雙股RNA病毒。

當前29頁，總共42頁。當前30頁，總共42頁。病毒DNA早期mRNA早期蛋白（酶等）子代病毒DNA晚期mRNA病毒結構蛋白子代病毒子雙股DNA病毒復制宿主細胞轉錄酶當前31頁，總共42頁。單鏈正股RNA病毒（-）ssRNA親代病毒（+）ssRNA早期蛋白（+）ssRNAdsRNA復制中間型（-）ssRNA（+）ssRNA大量子代（+）ssRNA晚期蛋白裝配子代病毒當前32頁，總共42頁。單股負股RNA病毒病毒自身攜帶依賴RNA的RNA多聚酶。親代（-ssRNA）（+）mRNA蛋白質（+）ssRNA子代（-）sRNA子代病毒多聚酶當前33頁，總共42頁。逆轉錄病毒病毒RNA逆轉錄酶雙股DNA整合至宿主細胞（前病毒）mRNA病毒RNA結構蛋白裝配子代病毒RNA:DNA轉錄酶聚合酶當前34頁，總共42頁。四、組裝病毒核酸與衣殼裝配在一起，形成病毒子。絕大多數DNA病毒均在細胞核內組裝;RNA病毒和痘病毒在細胞漿內組裝。當前35頁，總共42頁。絕大多數無囊膜病毒釋放，一次同步，破壞宿主細胞膜，細胞裂解釋放病毒顆粒，細胞迅速死亡。絕大多數有囊膜病毒以出芽方式釋出時包上細胞核膜或細胞膜而成為成熟病毒。逐個釋出，非一次同步，細胞死亡緩慢。五、釋放當前36頁，總共42頁。VirusObtainingItsEnvelopefromHostCellMembranebyBudding

當前37頁，總共42頁。復制周期當前38頁，總共42頁。思考題1某種病毒DNA的堿基組成（摩爾百分比）如下：

A=32；G=16；T=40；C=12

該病毒DNA的特點如何？當前39頁，總共42頁。思考題2簡要說明怎樣進行構建cDNA文庫？當前40頁，總共42頁。思考題3組織培養的哺乳動物細胞S期長達5小時，經放射自顯影測定DNA復制的速度是0