微生物檢測段及注意事項微生物的檢，無論在理論研究還是在生產實踐中都具有重要的意義，本文對長量測定法、微生物計數法、生理指標法和商業化快速微生物檢測簡介紹了利用微生物重量，體積，大小，生理代謝物等指標的二十余種用的檢測方法簡要介了這些方法的原理應范圍和優缺點。一個微生物胞在合適的外界條件下，不斷的吸收營養物質，并按自己的代謝式進行新陳代謝。如果同化作用的速度超過了異化作用，則其原生質總量〔重量，體積，大小〕就不斷增加，于是出現了個體的生長現象如果這是一種平衡生長即各細胞組分是按恰當比例增長時，則到一定程度后就會發生繁殖，從而引起個體數目的增加，這時原的個體已經發展成一個群體隨群體中各個個體的進一步生長，就引起這一群體的生長，這可從其體積、重量、密度或濃度作指標來衡量。生物的生長不同于其他生物的生長生的個生長在科研上有一困難常況下也沒實際意義生物是以量取勝的，因此，微生的生長通常指群體的擴增生的長繁殖是在內外各種環境因相互作用下的綜合反映此長殖況就可作為研究各種生理生和遺傳等問題的重要指標同時，微生物在生產踐上的各種應用或對致病腐生物的防治都和他們的生長抑制緊密相關。所以有必要紹一下微生物生長情況的檢測方法然長意著原生質含量的增，所以測定的方法也都直接或間接的以次為根據，而測定

繁殖則都要立在計數這一基礎上生生長的衡量以其量體積，密度濃度，做指標來進行衡量。1.微生物計量法1.1

體積測量法又稱測菌絲度法，通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的長狀況。方法是，取一定量的待測培養液〔如10mL放在有刻度的心管中設一定的離時〔5min和〔5000rpm后出清夜出清夜體積菌濃度〕/10

絲度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標種法比較粗放便速需設定一致的處理條件，否則偏差很，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養物果有定偏差。稱干重法可用離心或濾法測定。一般干重為濕重的。離法，將一定體積測培養液倒入離心管中設一的心時間和速，進行離心，并清水離心洗滌

次，進行干。干燥可用烘箱在或100℃烘干，或采用紅外線烘干，也可在80℃或40℃下真空干燥，干燥后稱重如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過過濾后用少量水洗滌在40

下進行真空燥稱重發法較為煩，通常獲取的微生物產品為菌體時，常采用這種方法，如活性干酵母〔ActivityADY〕一以微生物菌體為活性物的飼料和肥料

6006001.3

比濁法微生物的生引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時蹤時可用種特制的有側臂的三角燒瓶將臂插入光電比色計比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用發酵工業菌體生長監測。如使用UNICO

公司的紫外可見分光光度計在波長600nm處比管定時測發酵液的吸光光度值OD1.4

，以此監控生長及誘導時間。菌絲長度測法對于絲狀真和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度或是利用一只一端開口帶有刻度的細玻璃管入合適的培養基，放，在開口的一端接種微生物，一段時間后記錄其菌絲生長長度，借衡量絲狀微生物的生長。2.微生物計數法2.1

血球計數板血球計數板一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條，中央有一短橫溝和兩個平臺嵴表比兩平的外表高mm

，每個平臺刻有不同規格的格網，中央mm面上有400

個小方格。過油鏡觀察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出mL菌中所含的菌體數。種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜于單細胞狀的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數且得結果是包括細胞在內的總菌數。

2.2

染色計數法為了彌補一微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區死細胞和活細胞的不足人發了色計數法借助不同的染料對體進行適當的染色以方的顯鏡下進行活菌計數。如酵母細胞計數可用美藍染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，死細胞為藍色。2.3

比例計數法將已知顆粒如霉菌孢子或紅細胞〕濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一比例均勻混合在顯微視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的胞濃度。這種計數方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液標準。2.4

液體稀釋法對未知菌樣連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍釋液各取mL試，接種mL到組共只培養液的試管中，培養后記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然后查最大或然數表MPNNumber得菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生限量檢查。2.5

平板菌落計法這是一種最用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋，取一定體積的稀釋液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合將液涂布于已凝固的體培養基平板上。保溫培養后平上出現的落數乘

以菌液稀釋可算出原菌液的含菌數般直的板上出現

個菌落為宜但法比較麻煩操作者需有熟練的技術平菌落計數法僅可以得出菌液中活菌的含菌數且時將菌液中的細菌進行了一別離培養，獲得了單克隆。2.6

試劑紙在平板計數的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型濾紙片脂等濾和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活指示劑2,3,氯化三苯基四氮唑，無色〕待取測試菌液后置封包裝袋中培養期養后在濾紙上出現一定度的玫瑰色微小菌與標準紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量劑紙法計數快準確，相比而言防止了平板計數法的人為操作誤差。2.7

膜過濾法用特殊的濾過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察胞的熒光細會發色熒光死胞則發綠色熒光。3.間接測定法微生物的生伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸堿度，發酵液中的含氮，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為長測定的相對值此利用生理指標等間接參來測定生物量。3.1

測定含氮量大多數細菌含氮量為干重的，母，菌為。根據含氮量即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用

222222222222233硫酸，過氯，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N氣。Dumas測N氣法是將樣與CuO

混合在CO

氣流中加熱產生氮氣收在呼吸計中，用吸去CO后可測出N的。3.2

測定含碳量將少量〔干0.2~2.0〕物材料混入1mL

水或無機緩液中，用mL2%KCr

溶液在℃加熱30

分鐘后冷卻加水稀釋至mL，在的長讀吸光光度，即可推算出生長量。需用試劑做空白對，用標準樣品做標準曲線。復原糖測定復原糖通常指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過復原糖的測定可間反映微生物的生長狀況用大模業發酵生產上微生物生長的規監測法心酵上液入林劑沸水浴煮沸3分鐘，出加少許鹽酸酸化，加入

臨近終點時入淀粉溶液繼續加N

至終點，查讀出復原糖的含量。3.4

氨基氮的測離心發酵液清液甲基紅和鹽酸作指示劑0.02mol/L的調色至顏色剛剛褪去，加入底物18%中甲，應刻，加入0.02mol/L

的使之變色據NaOH

的用量折算氨基氮的含量據培養液中基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。3.5

其他生理物的測定DNARNA〔酰壁酸等量及酸氣產CO

〔用標記葡糖做基質〕，耗氧，黏度，產熱等指標，都可用于2

生長量的測。也可以根據反應前后的基質濃度變化，最終產氣量，微生物活性三面的測定反映微生物的生長。如在BMP-2

的發酵生產，隨時監測溶量的變化和酸堿度的變化，判斷細菌的長勢。4.商業化快速微生物檢測法微生物的檢，其發展方向是快速，準確，簡便，自動化，當前很多生物制品司利用傳統微生物檢測原理，結合不同的檢測方法計了形式各異微生物檢測儀器設備逐廣應于醫學微物檢測和科學研究域。例如：4.1

試劑盒，培基等手段抗干擾培養和微生物數量快速檢測技術結合解決了傳統微生物檢測手段不解決的難題建立一完整的抗干擾微生物檢測系統奠定了堅實的礎。如：抗干擾微生物培養基，新型生化鑒定管，微生物計數卡，環質量檢測試劑盒等，可方便的用于多項檢測。4.2

借助新型先儀器BACTOMETER

全自動各類菌數及快速細菌檢測系統可以數小時內獲得監測果樣顏及光學特都不影響讀數對母和霉菌檢測同樣高度感原理是利用電阻抗法〔Impedance〕將待測樣本與培養基于反應試劑盒內，底部有一對不銹鋼電極，測定因微生物生長而產生抗改變微物生長時可將培養基中的大分子營養物經代謝轉變為躍小分子電抗法可測試這種微弱變化，從而比傳統平板法更快速測微生物的存在及數量項目包括總生菌數母，

大腸桿菌群霉菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌等。微生物OD值反映菌體生長狀態的一指標OD是〔光密度的寫示檢測物吸收掉的光密度常400～700nm都是微生物測的范圍，需要紫外分光光度計測最大吸收波長得多的是：505nm

測菌絲菌體560nm

測酵母、600nm

測細菌。用OD

方法畫微生物長曲線時同株菌的起始培養濃度可以準備多管〔根據值就行了。檢測點的需，如需檢測10出來測OD

個點，就準10

管〕，然后個點取一管一般測菌體度的OD的長范圍是nm-660nm，如枯芽孢桿菌用nm已經屬于可見光〔200～nm為紫光400nm～800nm

為可見光區。空白如用水做，需要離心洗滌菌體；空白如用不接種的培養做就不需要洗滌是接種的培養基要和接種同時培養以求條件致，最后意一般值控在最好，這個區內的值就可靠，如OD

大于，一般稀釋后再測，因為OD

太大，分光度計的靈敏度會顯著降低。一般都測吸值，而且最好是整個實驗過程中，保持發酵液或菌體的稀釋倍數致吸值稀釋倍數一定成正比，可保證整個實驗點有可比性。取值的時候要連續讀數，重復

次的數最好另，分光度計微生的OD值為什么要把波長設為這個波長其只是針對濁度分光光度計在600nm處對濁度的反應比較靈敏測吸收峰的實際意義并不大，比方LB

搖瓶培養過的大

242444242444242444腸桿菌，其在多米的吸收最，但那很可能是培養液的吸收峰。部分發產品配方和藝(二)纖維素菌種：黑曲霉GD-6。種子培養基皮2.0%萄糖42SO40.15%～℃，培養40h。發酵培養基：酵母膏1.0%，蛋白胨)HPO40.2%，KHPO0.02%PO0.08%0.09%～℃養。黃原膠菌種：黃單孢菌。發酵培養基：葡萄糖，酵母粉0.05%，豆粕粉0.02%，機鹽適量。發酵參考環境：100噸罐，攪拌轉速115轉/分，罐壓斤，最高通風量分，pH在左右，℃,發酵周期72，發酵液最高粘度mPas左右。蟲草多發酵培養基萄糖4.0%豆餅粉膏0.5%40.25%，MgSO0.15%。發酵參考環境5100噸罐攪拌轉速140轉/通風量分罐壓公斤，培養4572時。細菌纖素菌種：AcetobacterNUST4發酵培養基：葡萄糖2.4%，蔗糖蛋白胨1.6%醋酸0.24%，NaHPO3.5%，PO0.1%，MgSO0.6%FeSO0.0015%，。Mg2+

最

24244，～。24244，～。44244444適添加量為g/L;0.015Fe時纖維素產量達最大；添加g/L煙酸、0.02g/L生物素和20mL/L乙醇時纖維素產量達9.87g/L菌種：木醋桿菌。發酵培養基：蔗糖，蛋白胨檸檬酸KHPO0.2%MgSO0.03%，乙醇

HPO培養條件：，溫度℃，培養周期6ｄ。細菌纖維素產量干重為2g/L。發酵完畢后過濾收集粗纖維，再用4%NaOH溶液沖洗，去離子水和0.5%酸反復沖洗，即獲細菌纖維素。頭孢菌菌種：頂頭孢霉。種子培養基：玉米漿，蔗糖，葡萄糖，DL-蛋氨酸豆油，3發酵培養基米漿粉精氨酸萄糖油3(NH)S0，FeSO，MnSO，ZnSO，CuSO，～。

，發酵參考環境：100噸罐，攪拌轉速115轉/分，罐壓斤，最高通風量1:1/分pH在左右，周期小時。螺旋霉菌種：螺旋霉素鏈霉菌。發酵參考環境：100噸罐，攪拌轉速115轉/分，罐壓斤，最高通風量1:1/分發酵周期130小時左右。根據螺旋霉素生物合成的研究結果，短鏈脂肪酸是合成螺旋霉素的前體，結果發現在發酵培養h后添加度的乙醇，能夠提高其發酵效價10%左右。加入豆油能較大幅度地提高螺旋霉素的發酵效價。在培養48h加入較在基礎料中加入更能提高螺旋霉素發酵效價，豆油的濃度以1%好。利福霉菌種：地中海諾卡氏菌。

％，4242443％，42424432432422443培養基萄糖10%淀粉餅粉1%白胨粉，各種無機鹽適量。發酵參考環境：100噸罐，攪拌轉速115轉/分，罐壓斤，最高通風量1:1/分發酵周期130小時左右。紅霉素菌種：紅色鏈霉菌。培養基：液化淀粉，葡萄4%，黃豆餅4%，正丙1%，無機鹽適量。培養基B黃豆餅粉％，葡萄糖4，淀粉4，糊精2%CaCO3(NH)SO0.15%，PO％，0.2%MgSO0.02%。發酵參考環境：100噸罐，攪拌轉速115轉/，最高通風量分，pH自然，℃，周期時。潔霉素菌種：鏈霉菌。發酵培養基豆餅粉2.5%漿42SO40.5%4%NaCl0.6%，0.9%，玉米淀粉2.5%，葡萄糖，PO0.07%。發酵參考環境100噸罐拌轉速100轉風量分壓公斤7培養溫度：060，31℃；60～130，30℃；130h至放31℃。發酵液初期粘度最大到130mPas，發酵周期小時。土霉素培養基黃豆餅粉玉米漿淀粉42SO41.2%NaCl0.2%CaCO1.1%，PO0.015%每罐外加5～10噸。發酵參考環境5100噸罐攪拌轉速140轉/通風量分罐壓公斤。環孢素培養基：葡萄糖2%面粉，干酪素～，3

0.15%KHPO0.2%，0.05%，0.005%，CaCO0.2%

424424324243發酵參考環境100噸罐拌轉速140轉風量分壓公斤發酵時間4天左右，溫度25度左右。其中通氣和培養溫度對的生物合成量影響非常大。納他霉菌種：褐黃孢鏈霉菌。培養基大豆蛋白胨l.8%酵母粉0.45%葡萄糖3.6%發酵時間h左右。慶大霉菌種：慶大小單孢菌。培養基：淀粉，玉米粉，豆餅粉，蛋白胨0.3%(NH)SO0.1%，CaCO0.5%，每罐外加CoCl8～10。發酵參考環境：100噸罐，攪拌轉速140轉/分，通風1:1/分，罐壓公斤，～，發酵周期80小時。金霉素菌種：金色鏈霉菌。培養基及培養條件：玉米淀粉8.5%，生粉黃豆粉，淀粉酶酶活力2000IU/mL))SO0.5%0.7%，蛋白胨，酵母粉，29±0.5℃，發酵培養h。小諾霉菌種:棘孢小單孢

4

0.025%，豆油mL/100mL在溫度種子培養基：黃豆餅粉l.5%，葡萄糖玉米粉，魚粉0.2%，淀粉4%。發酵培養基葡萄糖0.5%淀粉米粉1.5%熱榨黃豆餅粉2.5%，蛋白胨，硫酸銨0.05%，。四環素

42444224244422322424443培養基主要成分：液化淀粉，玉米漿，黃豆粉KH24，每罐外加二巰基苯并噻唑和NaBr。發酵參考環境5100噸罐攪拌轉速140轉/通風量分罐壓公斤，左右。部分發產品配方和藝(一)赤霉素酵1060罐，攪拌轉速115轉，通風量分，培養溫度大多采用29℃～32℃養基的起pH值控制在左右發酵過程的pH維持在～之間為宜。種子培養基：葡萄糖1.5%，豆餅粉淀粉1.0%240.1%，(NH)SO0.05%，0.1%，自然值。發酵培養基：豆餅粉0.9%．淀粉葡萄糖1.0%240.15%，MgSO0.08%，淀粉酶，～發酵周期小時阿維菌種子培養基：淀粉3.0%，豆餅粉酵母粉0.2%CoClppm～。

·6HO0.5發酵培養基：淀粉5.0%，玉米粉酵母粉，豆餅粉，CaCO0.2%，·6HO0.5，～。妥布霉發酵菌種：黑暗鏈霉菌。發酵培養基豆餅粉2.5%萄糖1.0%粉1.0%米淀粉，(NH)SO0.5%，魚粉0.4%MgS0，油ZnSO0.05%CaCO0.6%，溫度37℃，發酵時間h左右。氫化可松菌種：藍色犁頭霉(AS365)

43432444434324442433發酵培養基萄糖1.0%浸膏米漿1.5%銨0.5%28℃培養24，投0.25%的〔醋酯化合物17羥基孕甾-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯，RSA〕，轉化3642h寧南霉菌種：諾爾斯鏈霉菌西昌變種孢子斜面培養基溶性淀粉2%糖1.0%鉀40.5%MgSO0.5%，NaCl，CaCO0.5%，硫酸亞鐵0.01%瓊脂2.0%，滅菌前～。種子培養基米粉2.0%豆餅粉母粉0.01%40.01%，MgSO0.0025%，0.02%CaCO0.03%，初始。發酵培養基：玉米粉2.0%，淀粉花生餅粉酵母粉KHPO0.02%，0.05%，)SO0.25%，0.5%，初始。發酵48h達發酵高峰。多抗霉發酵培養基：玉米粉1.5%，豆餅粉飴糖2.0%240.1%，NaCl0.1%，0.3%，。10％接種量，℃，BT該菌生長的最適pH在弱堿性條件有利于芽泡及晶體的形成增加培養基中糖含量顯著提高菌體的生長量但對芽孢及晶體的形成均有一定影響高通氣量有利于菌的生長可縮短發酵周期期通氣量過大影響芽孢及晶體形成。該菌發酵的最正確工藝條件為：控制發酵溫度在；發酵前期包括延遲期速期數期制在用達1:2.0的大通氣量，1:2.0，為菌的生長提供良好的環境，盡可能提高菌數高于7.5

10；發酵后期減速期期pH當減小通氣旦到更有利于菌體向芽孢及伴孢晶體轉化(98以上)。

42424224液體培養基：I號培養基：牛肉膏，蛋白胨，；II號培養基：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，葡萄糖，。衣康酸菌種：土曲霉。發酵參考環境5100噸罐攪拌轉速100轉/通風量分罐壓公斤，左右。培養基：葡萄糖米糠各種無機鹽適量。發酵周期90小時。曲酸菌種：黃曲霉。發酵參考環境5100噸罐攪拌轉速100轉/通風量分罐壓公斤，左右。培養基要成分為液化淀粉14%種無機鹽適量酵周期小時。菌種：米曲霉。利用豆渣的發酵培養基80%膏

·7HO0.16%，自然；℃發酵培養，56d菌體生長量和曲酸產量最大。利用黃漿水發酵培養基為萄糖12%母膏％

·7HO，KHPO0.05%，黃漿水，為。℃發酵培養56d菌體生長量和曲酸產量最大。檸檬酸菌種：黑曲霉。發酵參考環境：100噸罐，攪拌轉速100轉/分，通風1:1/分，罐壓公斤，pH在左右；培養基主要成分為液化淀粉14%種無機鹽適量酸溫度為～36℃，發酵周期90時。谷氨酸菌種：谷氨酸棒桿菌。發酵參考環境：100噸罐，攪拌轉速100轉/分，通風1:1/分，罐壓公斤，pH在左右；

24242242422422423培養基主要成分：葡萄糖13%，·7H2O0.08%，240.08%，玉米漿糖蜜豆濃KCl，發酵周期時。賴氨酸菌種：谷氨酸棒桿菌。發酵參考環境：100噸罐，攪拌轉速100轉/分，通風1:1/分，罐壓公斤，pH在左右。種子培養基：葡萄糖1.5%，42SO0.4%，MgSO4·7H2Omg，玉米漿，尿素，3

3.0%，乙酸銨0.1%KHPO0.15%，豆濃0.86%，～，高壓滅菌15min。發酵培養基：葡萄糖15.0%42SO43.5%，MgSO4·7H2Omg，玉米漿乙酸銨0.9%生物素202HPO40.15%豆濃～。115℃壓滅菌15min。堿性蛋酶菌種：芽孢桿菌發酵培養基：可溶性淀粉，蛋白胨0.5%，2HPO40.4%，KHPO0.03%，CaCl0.1%，中性，121℃滅菌min。發酵培養基：玉米粉，餅粉，麩皮，40.4%，KHPO0.03%，ZnCl0.1%，，121℃滅菌min。發酵培養基：黃豆餅粉玉米粉，麩皮，24，NaHPO0.4%，CO0.1%，自然在36℃下通風培養，前期通風，后期通風，培養40h右。低溫堿蛋白酶菌種：黃海黃桿菌。

424242234242422342發酵培養基：豆餅粉(解液，加0.5%