基因治療現狀研究生第1頁/共101頁第一節基因治療概念

經典的基因治療：指正常的基因整合入細胞基因組以校正或置換致病基因的一種治療方法。廣義的基因治療：將某種遺傳物質轉移到患者細胞內，使其在體內發揮作用，以達到治療疾病目的的方法。目前基因治療：凡是采用分子生物學的方法和原理，在核酸水平上開展的疾病治療方法都可以稱為基因治療。第2頁/共101頁基因治療分類體細胞(somaticcell)基因治療生殖細胞(germline)基因治療只限于某一體細胞的基因的改變只限于某個體的當代對缺陷的生殖細胞進行矯正當代及子代第3頁/共101頁

1973年第一例人體實驗

1978年第二例基因治療實驗基因治療動物實驗廣泛開展

Dr.Anderson（1980）首先闡明基因治療前景和發展方向

Rosenberg（1990）利用逆轉錄病毒將基因導入腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL），并將TIF輸回體內，TIF集中在腫瘤部位，表達neoR。第4頁/共101頁1990年9月14日：第一例正式批準的基因治療實驗開始進行

（美國，世界上開展基因治療最早的國家）大規模進行基因治療臨床實驗必須經歷以下階段：體外試驗和動物試驗

I期臨床試驗——6---10名志愿者

II期臨床試驗——20---30名志愿者

III期臨床試驗——充分分析療效、安全性

中國

1991年7月開始進行基因治療試驗第5頁/共101頁

基因治療的策略TheStrategyofGeneTherapy第6頁/共101頁基因治療的策略大致可分為以下幾種基因置換

genereplacement基因修復

genecorrection基因修飾

geneaugmentation基因干預

geneinactivation自殺基因治療suicide

genetherapy基因免疫治療

immuneadjustment其他第7頁/共101頁

（一）基因置換（genereplacement）

定義：將特定的目的基因導入特定細胞，通過定位重組，以導入的正常基因置換基因組內原有的缺陷基因。

目的：將缺陷基因的異常序列進行矯正。對缺陷基因的缺陷部位進行精確的原位修復，不涉及基因組的任何改變。第8頁/共101頁又稱為基因打靶(genetargeting）定點整合的條件:轉導基因的載體與染色體上的DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點，進行部分基因序列的交換，使基因置換這一治療策略得以實現。基因同源重組技術★第9頁/共101頁要實現基因置換，需要采用同源重組技術使相應的正常基因定向導入受體細胞的基因缺陷部位。定向導入的發生率約1/100萬，采用胚胎干細胞培養的方法，這種同源重組的檢出率最高可達1/10。第10頁/共101頁基因置換必要條件：★1、對導入的基因及其產物有詳盡的了解2、外來基因能有效地導入靶細胞3、導入基因能在靶細胞中長期穩定存在4、導入基因能有適度水平的表達5、基因導入的方法及所用載體對宿主細胞安全無害第11頁/共101頁（二）基因修飾

基因添加或稱基因增補（geneaugmentation）:

通過導入外源基因使靶細胞表達其本身不表達的基因。類型:在有缺陷基因的細胞中導入相應的正常基因，而細胞內的缺陷基因并未除去，通過導入正常基因的表達產物，補償缺陷基因的功能；向靶細胞中導入靶細胞本來不表達的基因，利用其表達產物達到治療疾病的目的。第12頁/共101頁基因干預(geneinterference)

指采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因而使之不表達，以達到治療疾病的目的。反義核酸：封閉基因表達核酶：裂解特異的靶mRNARNA干涉技術：（三）基因干預第13頁/共101頁（四）自殺基因治療自殺基因治療(suicidegenetherapy)自殺基因治療:惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。原理:將“自殺”基因導入宿主細胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體在體內轉化為細胞毒性代謝物，誘導靶細胞產生“自殺”效應，從而達到清除腫瘤細胞的目的。第14頁/共101頁自殺基因的作用機制

第15頁/共101頁?TK/GCV

單純皰疹病毒（herpssimplexvirus,HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidinekinase,tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ganciclovir,GCV）轉變成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，導致細胞死亡。?CD/5-FC大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosinedeaminase,CD）基因，在細胞內將無毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）轉變成毒性產物5-氟尿嘧啶（5-FU）。1.自殺基因系統5-氟尿嘧啶通過競爭性抑制胸苷酸合酶的活性，從而抑制脫氧胸苷三磷酸的合成。第16頁/共101頁

旁觀者效應:“自殺基因”治療不僅使轉導了“自殺基因”的腫瘤細胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉導“自殺基因”的腫瘤細胞也被殺死。

2.旁觀者效應第17頁/共101頁（五）基因免疫治療

immuneadjustment

通過將抗癌免疫增強細胞因子或MHC基因導入腫瘤組織，以增強腫瘤微環境中的抗癌免疫反應。第18頁/共101頁第二節基因治療的必要條件★1、發病機制在DNA水平上已經清楚；2、要轉移的基因已經克隆分離，其表達產物有詳盡的了解；3、該基因正常表達的組織可在體外進行遺傳操作；第19頁/共101頁1、外源基因可有效導入靶細胞2、外源基因能在靶細胞中長期穩定存留3、導入基因能適量表達4、導入基因的方法及載體對宿主細胞安全無害理想的基因治療還必須：第20頁/共101頁基因轉移技術

TheTechniqueofGeneTransfer第21頁/共101頁基因治療的兩種途徑載體目的基因invivoexvivo靶細胞第22頁/共101頁

基因治療途徑1、間接體內治療途徑（exvivo）

是先從患者體內取出某一器官組織的細胞，體外擴增后，將目的基因轉入靶細胞形成表達外源基因的遺傳修飾細胞，選擇高表達的細胞擴增培養，以一定數量移植患者體內。（安全、易控制但操作復雜）2、直接體內治療途徑（invivo）

將目的基因體內直接轉移到靶細胞，所用載體必須具有特異的導向性和轉移效率。（操作簡單但療效短、免疫排斥等）第23頁/共101頁

基因轉移(genetransfer)技術：

1.病毒介導的基因轉移系統。

2.非病毒介導的基因轉移系統。第24頁/共101頁

1.病毒介導的基因轉移系統

病毒載體介導的基因轉移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據統計，有72%的臨床實驗計劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是逆轉錄病毒載體。第25頁/共101頁Retrovirus

（1）逆轉錄病毒

第26頁/共101頁第27頁/共101頁（1）兩端各有一長末端重復序列LTR。

逆轉錄病毒前病毒的結構特點

（2）LTR由U3、R和U5三部分組成。(1)在U3內有增強子和啟動子；

(2)U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS)；(3)在R內還有poly(A)加尾信號。

第28頁/共101頁（3）病毒有三個結構基因(1)gag基因，編碼核心蛋白及屬特異性抗原；(2)pol基因，編碼逆轉錄酶；(3)env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。

（4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包裝所必需的包裝信號序列（ψ）及剪接供體位點(SD)和剪接受體位點(SA)。

逆轉錄病毒前病毒的結構特點

第29頁/共101頁（5）含有負鏈DNA轉錄的引物結合位點(PBS)和正鏈DNA轉錄的引物結合位點(PPT)。

逆轉錄病毒前病毒的結構特點

第30頁/共101頁構成逆轉錄病毒介導的基因轉移系統

——逆轉錄病毒載體由兩部分組成：(1)保留病毒顆粒的包裝信號而缺失病毒蛋白基因第31頁/共101頁(2)輔助細胞株(如PA317)：它由缺陷型逆轉錄病毒感染構建而成第32頁/共101頁Retroviralpackagingsystem第33頁/共101頁LTRgagpolenvLTRGag蛋白PoL蛋白Env蛋白包裝細胞系LTRLTR靶細胞目的基因標記基因LTRφLTR目的基因標記基因12345假病毒顆粒的產生并感染靶細胞逆轉錄病毒載體重組逆轉錄病毒(核酸部分只能是逆轉錄病毒載體)輔病毒第34頁/共101頁

逆轉錄病毒載體的特點

①逆轉錄病毒包膜上由env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動物細胞膜上的特異性受體識別，從而使逆轉錄病毒攜帶的遺傳物質高效地進入靶細胞。

②逆轉錄病毒結構基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。

③前病毒可以高效整合至靶細胞基因組中，有利于外源基因在靶細胞中的永久表達。

④包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組逆轉錄病毒載體）以芽生的方式分泌至輔助細胞培養的上清液中，易于分離制備。

第35頁/共101頁

逆轉錄病毒載體的主要缺點

隨機整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險；逆轉錄病毒載體的容量較小，只能容納7kb以下的外源基因。第36頁/共101頁

（2）腺病毒(adenovirus，AV)載體

腺病毒是一種大分子(36kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它通過受體介導的內吞作用進入細胞內，腺病毒基因組轉移至細胞核內，保持在染色體外，不整合進入宿主細胞基因組中。

腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發現與腫瘤發生有關聯。宿主細胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細胞，如神經元等。第37頁/共101頁第38頁/共101頁腺病毒載體的優點1.基因導入效率高，對人類安全；2.宿主范圍廣；3.基因轉導與細胞分裂無關；4.重組腺病毒可通過口服經腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內滴注；5.腺病毒載體容量較大，可插入7.5kb外源基因；第39頁/共101頁

腺病毒載體缺點2.宿主的免疫反應導致腺病毒載體表達短暫。3.有兩個環節可能產生復制型腺病毒。4.靶向性差。

1.不能整合到靶細胞的基因組DNA中。分裂增殖快的細胞，導入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機會增多，表達時間相對較短。(1)腺病毒產生過程中與293輔助細胞內E1區序列發生同源重組；(2)腺病毒載體與被治療的患者體內已感染的野生型腺病毒，甚至乳頭瘤病毒、巨細胞病毒發生重組。第40頁/共101頁

（3）腺病毒相關病毒載體腺病毒相關病毒(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨立復制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時，才能進行復制和溶細胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。AAVVirusParticles第41頁/共101頁StructureofAAVVirusGenomicDNAREP:病毒復制基因,CAP:編碼衣殼蛋白的基因第42頁/共101頁AAV的特點●以潛伏感染為主；●病毒基因組與細胞共存；●只要宿主細胞正常，AAV基因表達就處于抑制而維持潛伏狀態；●若細胞受刺激，表達應激基因，AAV基因表達從而使AAV病毒復制；●產生子代病毒并釋放，又感染新的細胞，建立新的潛伏狀態。第43頁/共101頁

AAV載體是目前正在研究的一類新型安全載體，它對人類無致病性。

AAV可以高效定點整合至人19號染色體的特定區域19q13.4中，并能較穩定地存在。這種靶向定點整合可以避免隨機整合可能帶來的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險性，而且外源基因可以持續穩定表達，并可受到周圍基因的調控，兼具逆轉錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優點。

第44頁/共101頁

AAV載體的缺陷：

AAV載體容量小，目前最多只能容納5kb外源DNA片段；感染效率比逆轉錄病毒載體低。在40%-80%的成人中存在過感染，可能會引起免疫排斥。第45頁/共101頁第46頁/共101頁2.非病毒載體介導的基因轉移系統

（1）脂質體介導的基因轉移技術脂質體介導的基因轉移技術使用方便、成本低廉。

基本原理:利用陽離子脂質體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質體，然后與細胞一起孵育，即可通過細胞內吞作用將外源DNA（即目的基因）轉移至細胞內，并進行表達。

第47頁/共101頁

脂質體介導的基因轉移示意圖第48頁/共101頁脂質體介導法缺點：脂質體介導進入靶細胞內，易被單核-吞噬細胞系統選擇性吞噬、降解。第49頁/共101頁

（2）受體介導轉移技術

將DNA與細胞或組織親和性的配體偶聯，可使DNA具有靶向性。這種偶聯通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實現。多聚陽離子與配體共價連接后，又通過電荷相互作用與帶負電荷的DNA結合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復合物可被帶有特異性受體的靶細胞吞飲，從而將外源DNA導入靶細胞。缺點：受體介導的DNA通常進入細胞溶酶體內被降解。第50頁/共101頁受體介導轉移技術示意圖第51頁/共101頁

（3）基因直接注射技術不需要進行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因DNA注入動物肌肉或某些器官組織內。動物實驗表明：接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應的蛋白質，并能維持數月之久。

1.將促進心臟血管生長的基因直接注入實驗鼠的心臟，可使其心臟壁內毛細血管增加30%～40%；

2.將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素；

3.肌內注射凝血因子Ⅸ基因，可產生血友病所需的凝血因子等等。第52頁/共101頁

基因直接注射法的優點1.制備具有調控部件的質粒DNA重組體的技術較容易；2.排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用；3.導入的基因不需整合即可表達，避免了逆轉錄病毒載體導入整合后，一旦發生副作用不易中止或逆轉的缺點；4.基因直接注射法可反復使用，而病毒載體則可能誘導體內免疫應答，致使反復治療效果下降。第53頁/共101頁三、基因轉移的靶細胞靶細胞的選擇須考慮：1、容易取出和移植。血液系統的細胞、成纖維細胞、成肌細胞；2、細胞具有較長的壽命3、離體細胞較易受外源基因轉化4、離體細胞經轉染和一定時間培養后再植回體內，仍較易成活體細胞生殖細胞第54頁/共101頁目前常用的靶細胞有：1、造血細胞2、皮膚成纖維細胞3、肝細胞4、血管內皮細胞5、淋巴細胞6、肌肉細胞7、腫瘤細胞第55頁/共101頁基因干預

GeneInterference主要干擾特定細胞的mRNA轉錄和翻譯第56頁/共101頁基因干預的種類：1.反義RNA(antisenseRNA)2.干擾RNA(RNAinterference)3.核酶(ribozyme)第57頁/共101頁

（一）反義RNA1.反義RNA與基因表達調控

利用反義RNA對體外培養的細胞進行基因表達調控，通常采用的方法有兩種：（1）體外合成反義RNA，直接作用于培養細胞，細胞吸收RNA后，發揮作用。缺點：RNA易降解（2）構建能轉錄反義RNA的重組質粒，將質粒轉入細胞，轉錄出反義RNA而發揮作用缺點：細胞內轉錄的反義RNA量不易控制第58頁/共101頁

反義RNA的關鍵技術問題：?反義RNA進入靶細胞前的降解問題?專一性轉移問題：如何解決某一組織、器官或系統中部分細胞病變進行專一性轉移治療。

第59頁/共101頁2.受體介導反義RNA轉移技術

①受體介導的RNA轉移十分專一，而且效率高；②被轉移的RNA是被保護的，與周圍環境之間存在多聚賴氨酸的保護層,可以抵抗環境中的核酸酶的降解作用。

將脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）與多聚賴氨酸（PL）共價連接，得到ASGP-PL復合物，成為運載核酸的工具。ASGP-PL反義RNA復合物可以專一性地被肝細胞表面的ASGP受體所識別，并吞噬到肝細胞中，反義RNA進入肝細胞后，可被逐漸釋放出來發揮作用。

借助受體介導DNA轉移方法把DNA換成反義RNA，就可以實現受體介導的反義RNA的轉移。第60頁/共101頁

3.反義RNA的應用前景

受體介導的反義RNA基因治療有其自身的優點，而在一定程度上補充了轉基因治療的不足。

（l）安全性高

（2）反義RNA設計和制備方便

（3）具有劑量調節效應

（4）能直接作用于一些RNA病毒

反義RNA只作用于特異的mRNA分子，不改變所調節基因的結構。反義RNA分子無論怎樣修飾，最終將在細胞內部被降解，不留“殘渣”。

在治療RNA病毒感染性疾病時，受體介導的反義RNA基因治療比一般的DNA基因治療有更大的優勢。利用反義RNA可以直接作用于病毒RNA，阻斷RNA病毒的繁殖。第61頁/共101頁（二）RNA干擾

對RNA干擾的認識來源于用線蟲（C.elegans）和果蠅所進行的實驗。實驗結果顯示，有義鏈RNA（senseRNA）或反義鏈RNA（antisenseRNA）均能抑制線蟲基因的表達，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。將特異的雙鏈RNA注入線蟲體內可抑制有同源序列的基因的表達。得到的結果是有義鏈RNA和反義鏈RNA都同樣阻斷基因表達途徑。這與傳統上對反義RNA技術的解釋正好相反。而且其抑制基因表達的效率比反義RNA至少高2個數量級。1.RNA干擾現象

★RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達。第62頁/共101頁

2.RNA干擾的機制

RNA干擾過程主要有2個步驟：

（1）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細胞內的某些酶和蛋白質形成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。

該復合體可識別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷。

長雙鏈RNA被細胞內的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21-23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。第63頁/共101頁A.賈第鞭毛蟲Dicer的晶體結構；RNA干擾機制示意圖

第64頁/共101頁

1.體外化學合成;

2.用質粒載體或病毒載體可在細胞內穩定地生成。siRNA的產生第65頁/共101頁

3.RNA干擾的應用前景

RNA干擾研究目前已經在功能基因組學研究、微生物學研究、基因治療和信號轉導等廣泛領域取得了令人矚目的進展，使其在醫學、生物學領域的應用有著廣闊的前景。第66頁/共101頁（1）研究基因功能的新工具

由于RNA干擾技術具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具。

RNA干擾技術能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，建立多種表型；抑制基因表達的時間可以控制在發育的任何階段，產生類似基因敲除的效應。

第67頁/共101頁

（2）腫瘤的基因治療

傳統反義RNA技術誘發的單一癌基因的阻斷，不可能完全抑制或逆轉腫瘤的生長，而RNA干擾技術可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設計針對這一區段序列的雙鏈RNA分子，只使用一種雙鏈RNA即可以產生多個基因同時剔除的表型，也可以同時使用多種雙鏈RNA而將多個序列不相關的基因同時剔除。RNA干擾技術可用于治療有異常基因表達的惡性腫瘤。

第68頁/共101頁

▲

K-RAS蛋白為腫瘤發生所必需；

◆

bcr/ab1融合基因與人白血病有關，

用RNA干擾技術

*

可以阻礙K-RAS蛋白的表達從而抑制腫瘤發生；

*

或殺死有bcr/ab1的人白血病細胞系。通過RNA干擾抑制某些內源性基因的表達，能促進白血病細胞系的細胞凋亡或增加其對化療藥物的反應性。

第69頁/共101頁

（3）病毒性疾病的基因治療

RNA干擾可以被看成是一種與免疫系統類似的防御機制。用siRNA抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表達，如P24、Vif、nef、tat或rev，阻礙HIV在細胞內復制。用RNA干擾技術抑制HIV的受體（CD4）或輔助受體（CXCR4或CCR5）在細胞內表達，可阻礙HIV感染細胞。也可通過RNA干擾抑制其他病毒在細胞內復制，如脊髓灰質炎病毒、人乳頭狀瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。第70頁/共101頁

siRNA在病毒感染的早期階段能有效地抑制病毒的復制，病毒感染能被針對病毒基因和相關宿主基因的siRNA所阻斷，RNA干擾技術將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對于許多嚴重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意義。第71頁/共101頁（三）核酶(ribozyme)用于基因治療

天然核酶多為單一的RNA分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由兩個RNA分子組成。

在基因治療時，利用核酶分子結合到靶RNA分子中適當的鄰位，形成錘頭核酶結構，將靶RNA分子切斷，通過破壞靶RNA分子達到治療疾病（如清除病毒基因組RNA）的目的。只要兩個RNA分子通過互補序列相結合，形成錘頭狀的二級結構（3個螺旋區），并能組成核酶的核心序列（13個或11個保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產生剪切反應。第72頁/共101頁錘頭型核酶的二級結構和空間立體結構示意圖三個雙螺旋區13個核苷酸殘基保守序列剪切反應在右上方GUX序列的3‘端自動發生（N代表任意核苷酸，H代表A,U或C）第73頁/共101頁

1.核酶的設計

核酶是通過靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結構域，要從靶分子和核酶分子兩個方面來設計核酶。

（1）選擇合適的靶部位，該部位具有核酶切割位點，能與核酶分子結合并組成酶活性結構域。

（2）核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結構域），兩端是引導序列。

在基因治療中，主要是根據治療的靶基因序列的特點，設計和合成特定的核酶。設計的基本原則是核酶分子與靶部位結合后能形成酶活性結構域。

第74頁/共101頁核酶的作用機制

第75頁/共101頁

2.核酶的應用

與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩定的空間結構，不易受到RNA酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結合和切割其它的mRNA分子。

第76頁/共101頁核酶導入細胞方法1、外源導入法：可以通過化學合成；也可以采用體外轉錄方法2、內源導入法：利用表達載體在細胞內轉錄產生核酶分子。第77頁/共101頁治療基因的受控表達

RegulatedExpressionofTherapeuticGene第78頁/共101頁

時間:

治療基因的受控表達包括控制治療基因表達的時間、空間和水平三個方面。

空間:表達水平：希望治療基因能在一個適當的水平表達。

1.控制治療的基因在患者需要實施治療時才表達，而平時不需要進行治療時則處于關閉狀態；

2.根據不同疾病的治療要求，控制治療基因持續表達的時間跨度。

是指為了提高基因治療的專一性和安全性，嚴格限制治療基因只在靶細胞中表達，避免治療基因指導合成的蛋白質干擾非靶細胞的正常生活，產生毒副作用。第79頁/共101頁

要實現治療基因的受控表達，必須建立完善的基因表達調控體系。

基因調控策略大致有以下幾種：

基因內部調節機制基因外部調節機制利用病灶微環境使治療基因特異性表達以及治療基因的誘導表達等第80頁/共101頁?使用正常細胞的組織特異性啟動子、增強子元件?使用病變細胞的組織特異性啟動子、增強子元件（一）基因內部的調節機制第81頁/共101頁

1.使用正常細胞的組織特異性啟動子、增強子元件

例如，酪氨酸酶是皮膚細胞和黑色素瘤細胞產生色素途徑中的一種酶，可利用其啟動子驅動治療基因只在黑色素瘤細胞中表達，而不在正常的周邊細胞中表達。

不同類型的正常細胞或組織中往往存在某些特有的蛋白質，它們的基因表達調控元件可用于驅動治療基因的特異性表達，從而起到治療作用。

前列腺特異性抗原(PSA)是參與精液凝塊中蛋白質降解、使精液液化的一種絲氨酸蛋白酶。它主要在前列腺中產生，而在前列腺癌細胞中含量很高，可以利用PSA基因調控元件驅動治療基因在PSA陽性的前列腺癌細胞中表達而發揮作用，而其在PSA陰性細胞和非前列腺癌細胞中不能使治療基因表達。第82頁/共101頁

2.使用病變細胞的組織特異性啟動子、增強子元件

某些病變的細胞或組織產生一些特殊的蛋白質，其基因表達調節元件也可以用來控制治療基因的特異性表達。

甲胎蛋白(AFP)基因正常情況下只在胚胎肝細胞中表達，不在成年肝臟細胞中表達。肝細胞腺癌細胞中AFP基因異常激活，因此可利用該基因啟動子驅動治療基因(如自殺基因)在癌細胞中表達，使癌細胞經給藥后被殺死。癌胚抗原(CEA)是膜糖蛋白家族的成員，在許多腺癌細胞中表達很高，采用其啟動子可以使治療基因只在CEA陽性的癌細胞中表達，而不會在陰性細胞中表達。第83頁/共101頁（二）基因外部的調節機制

除利用基因內部的調節機制以外，還可通過施加外部刺激，促進治療基因在特定細胞或組織中表達。

采用熱休克蛋白基因的表達調控元件來啟動治療基因，可以通過對病灶局部進行熱處理，達到使治療基因特異性表達的目的。

組織纖溶酶原激活物(t-PA)作為溶解血栓的藥劑，在中風和心肌梗死等疾病治療中起著重要的作用。t-PA的活性在輻射后增加50倍，表明其基因表達調控元件中存在受輻射誘導的調控元件，故可利用其調控元件啟動治療基因的表達，增強放療效果。第84頁/共101頁（三）利用病灶微環境使治療基因特異性表達

病灶微環境與正常時往往不同，因此可利用這些變化控制治療基因的表達。

例如，在腫瘤病灶處，常常出現葡萄糖缺乏等情況，葡萄糖調節蛋白GRP78/Bip的含量也隨之增加，使癌細胞能夠抵御應激。當采用這種基因的啟動子來控制治療基因時，可以使治療基因在腫瘤細胞中表達，使腫瘤組織壞死。

第85頁/共101頁

腫瘤細胞生長速度快于形成血管的內皮細胞，造成供血不足，因此在腫瘤內部形成酸性、缺氧和營養缺乏的區域。缺氧條件可以通過缺氧誘導因子(HIF-1)和缺氧響應元件(HRE)相互作用，調節一些基因的表達；如果采用缺氧響應元件(HRE)來控制治療基因的表達，即可實現治療基因只在缺氧的腫瘤組織中表達，而在正常組織中不表達。

（三）利用病灶微環境使治療基因特異性表達

第86頁/共101頁（四）治療基因的誘導表達

采用組織特異性啟動子控制治療基因的表達，可能造成這些基因在靶細胞中表達，不再受外界控制。為了避免這種情況發生，研究人員正在開發和完善一些可誘導性基因表達系統。這種系統的必要成分：一種是轉錄激活劑，它只在誘導藥物存在時才能與DNA結合；另一種則是特異性基因表達調控元件，僅對這種轉錄激活劑有所響應。

第87頁/共101頁四環素抗性操縱子系統原理四環素抗性基因的轉錄受Tet阻遏蛋白的負調控。無四環素存在時，阻遏蛋白與四環素抗性操縱子序列結合阻斷四環素抗性基因的表達；四環素存在時，阻遏蛋白與四環素具有極高的親和性，造成阻遏蛋白對四環素抗性操縱子阻遏解除，使四環素抗性基因的轉錄得以進行。。

第88頁/共101頁基因治療的應用研究TheApplicationofGeneTherapy第89頁/共101頁

世界上第一個正式被批準用于基因治療的病例是先天性腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥。1990年9月美國Blaese博士成功地將正常的人的ADA基因植入ADA缺乏癥病人的淋巴結內，完成世界上首例基因治療試驗。第90頁/共101頁腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的

嚴重聯合免疫缺陷(SCID)病因:淋巴細胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆積破壞免疫功能患兒很少活到成年第一個基因臨床治療的方案(1990.9.14,NIH)治療策略：淋巴細胞ADA酶恢復至正常水平的

5%-10%

維持免疫系統功能改善病人癥狀第91頁/共101頁治療基本步驟:ADA基因+逆轉錄病毒載體導入患者淋巴細胞體外擴增回輸病人體內淋巴細胞ADA酶恢復至正常水平的5%-10%

維持免疫系統功能,改善病人癥狀第92頁/共101頁（一）遺傳病的基因治療研究

已知人類有4000多種遺傳病，在人群中的發病率約為40％～50％。但真正了解病因，能進行產前診斷的僅限于那些為數不多的常見遺傳病。

1.在DNA水平明確