凍干流行性乙型腦炎活疫苗制造及檢定規程本品系將流行性乙型腦炎（下稱乙腦）SA14-14-2減毒株病毒接種于原代地鼠腎單層細胞，經培育后收獲病毒液，加保護劑凍干制成。用于預防乙腦。1毒種1.1毒種來源乙腦SA14-14-2減毒株病毒。由中國藥品生物制品檢定所檢定與分發。該毒株經用乙腦敏感動物試驗證明其嗜神經毒力減弱，經檢查無外源因子存在，用乙腦特異性免疫血清做中和試驗證實為乙腦病毒，并經免疫力試驗證明具有免疫原性，經臨床觀察證明安全有效。1.2生產毒種批制備毒種啟封后，在地鼠腎單層細胞上增殖傳遞，傳遞代數不得超過3代。從原始毒種算起，總代數不是超過10代。在傳代細胞病變明顯時收獲病毒液，經檢定合格后為生產毒種批。1.3毒種檢定1.3.1無菌試驗按《生物制品無菌試驗規程》進行。1.3.2支原體檢查按《生物制品無菌試驗規程》進行。1.3.3病毒滴定抽樣品做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6三個稀釋度的病毒液，分別接種BHK21細胞，用蝕斑法進行滴定，病毒滴度≥7.2LogPFU/1.0ml為合格。凍干毒種批的滴度≥5.7LogPFU/1.0ml為合格。做病毒滴定同時應用參考苗進行滴定，以判斷試驗結果是否成立。1.3.4純毒試驗生產毒種批與非同源性乙腦高價免疫血清混合，置37℃90分鐘，接種地鼠腎單層細胞或BHK21細胞進行中和試驗，觀察5～7天判定結果。乙腦病毒完全被中和（無細胞病變或蝕斑出現）為合格，如仍有病變或蝕斑出現，應按上述方法再行中和。1.3.5腦內致病力試驗生產毒種批原液接種體重12～14g小白鼠10只，每只腦內注射0.03ml，接種后3天內死亡者不計，觀察14天應活存。3天后如有小白鼠發病，應殺死取腦測定致病力，對小白鼠的腦內毒力不應超過3.0LogLD50/0.03ml，同時小白鼠皮下注射0.1ml10-1病鼠腦懸液進行皮下致病力試驗，觀察14天，應健存。1.3.6皮下感染人腦試驗生產毒種批原液接種體重10～12g小白鼠10只，每只皮下注射0.1ml，同時右側腦內空刺，觀察14天，應健存。1.3.7乳鼠傳代返祖試驗生產毒種批原液接種3～5日齡乳鼠10只，每只腦內注射0.02ml。將發病的乳鼠殺死3只，解剖取腦測其致病力，用體重12～14g小白鼠測定，腦內毒力不應超過3.0LogLD50/0.03ml，同時皮下注射10只小白鼠，每只0.1ml10-1乳鼠腦懸液，觀察14天，應健存。1.3.8外源因子檢查生產毒種批經非同源性乙腦高價免疫血清中和后，進行細胞培養試驗。樣品分別接種人二倍體細胞、BHK21細胞、原代地鼠腎細胞，于33～35℃進行培育，同時做對照培育。培育7、14天細胞應無病變，分別進行次代培育和血吸附試驗；次代培育7、14天時亦分別觀察細胞病變和進行血吸附試驗。結果均無細胞病變并血吸附試驗陰性為合格。血吸附試驗方法：觀察到期的細胞，用0.2%～0.5%雞、豚鼠紅細胞混合液于4～8℃、20～25℃中依次進行血吸附檢查。所用紅細胞于2～8℃保存應不超過7天。1.3.9細胞基質外源因子檢查制備生產用種子批的細胞留取5%～10%不種毒，更換相應的維持液，置33～35℃培育。在培育7、14天時，鏡下觀察無細胞病變后分別做血吸附試驗（方法同1.3.8項）。細胞無病變并血吸附試驗陰性為合格。1.4生產毒種批保存液體生產毒種批于-60℃保存不超過6個月可用于生產；凍干生產毒種批于-20℃以下保存2年內可用于生產。2疫苗制造2.1細胞制備2.1.1地鼠選用10～14日齡健康地鼠，解剖取腎。如發現腎臟異常或有乳糜狀腹水，應廢棄。2.1.2疫苗生產過程中不得使用青毒素或其他β內酰胺類抗生素。2.1.3細胞消化及培養解剖取出腎臟后剪成碎塊，用適量的胰蛋白酶液消化，將分散后的細胞懸液種入培養瓶內，加入生長液，置36～37℃培養。細胞生長成致密單層即可接種病毒。2.1.4外源因子檢查每批細胞留取5%～10%不接種病毒，加入與生產相同維持液后置33～35℃培育14天。在培育7、14天時分別做血吸附試驗（方法同1.3.8項）。在觀察期內細胞無病變并血吸附試驗陰性為合格。如細胞出現病變或血吸附試驗陽性，由該批細胞制備的病毒原液應廢棄。2.2病毒接種和培育挑選長成致密單層的細胞，用洗液充分洗滌后加適量維持液，病毒接種量為2.7～3.7LogPFU/1.0ml，置35～36℃培育。2.3原液2.3.1收獲病毒液種毒后培育72小時以上，細胞出現明顯病變時收獲病毒液，澄清過濾后為原液。2.3.2原液檢定2.3.2.1無菌試驗每瓶原液分別取樣做無菌試驗，樣品種入硫乙醇酸鹽、乙良馬丁和肝斜面培養基，培養8天判定結果。2.3.2.2支原體檢查按《生物制品無菌試驗規程》進行。2.3.2.3純毒試驗每一消化批應抽樣進行純毒試驗。方法同1.3.4項。2.3.2.4病毒滴定方法同1.3.3項。滴度≥7.2LogPFU/1.0ml為合格。2.4疫苗半成品2.4.1疫苗混合檢定合格的原液合并后，加適宜保護劑。每批疫苗量應不超過15萬ml。2.4.2無菌試驗按《生物制品無菌試驗規程》進行2.4.3分裝和凍干疫苗應在冰浴下進行分裝，采用適宜的凍干條件進行凍干。出柜后應在15℃以下進行封口。3成品檢定3.1外觀檢查凍干疫苗應為淡黃色疏松體。如稀釋液后迅速溶解，溶解后應為HYPERLINK\o"中藥材：橘紅"橘紅色透明液體，無異物。3.2殘余水分含量凍干疫苗殘余水分應≤3.5%。3.3pH值凍干疫苗用蒸餾水復溶后，pH值應為7.2～8.0。3.4病毒滴定方法同1.3.3項。病毒滴度≥5.7LogPFU/1.0ml為合格。3.5熱穩定性試驗凍干疫苗置37℃7天后進行滴定（方法同1.3.3項），滴度下降不應超過1.0LogPFU/ml。3.6無菌試驗按《生物制品無菌試驗規程》進行。3.7安全試驗3.7.1腦內致病力試驗方法及判定標準同1.3.5項。3.7.2皮下感染入腦試驗方法及判定標準同1.3.6項。3.7.3乳鼠傳代返祖試驗。方法及判定標準同1.3.7項。3.8毒性試驗凍干疫苗每支加稀釋液2.5ml溶解復原后，用體重12～15g小白鼠4只，每只腹腔注射0.5ml。注射后密切觀察，30分鐘內不應有異常反應，觀察3天應健存。3.9