第十三次課單克隆抗體從診斷到治療詳解演示文稿當前1頁，總共53頁。（優選）第十三次課單克隆抗體從診斷到治療當前2頁，總共53頁?！皌hespecificityindevelopmentandcontroloftheimmunesystem”andthethediscoveryof“theprincipleforproductionofmonoclonalantibodies”當前3頁，總共53頁。Natural-SelectionTheoryofantibodyformation（抗體形成過程中的自然選擇學說）1955年SomaticGenerationofimmuneRecognition（免疫系統的自我建立學說）1971年

NetworkTheory（免疫系統的相對穩態學說）1974年當前4頁，總共53頁。免疫相關疾病和生物學過程自身免疫疾病：類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡器官移植：免疫排斥過敏：有機體對某些藥物或外界刺激的感受性不正常地增高的現象；過分敏感疫苗：基因重組乙肝疫苗當前5頁，總共53頁。Tcell在胸腺中經歷陽性和陰性篩選過程當前6頁，總共53頁。當前7頁，總共53頁。1、多克隆抗體（polyclonalantibody,pAb）：

用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物，可刺激機體多個B細胞克隆產生針對多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物。

2、單克隆抗體（monoclonalantibodies,mAb）：

由一個識別一種抗原表位的B細胞克隆產生的同源抗體。高度均一、特異性強、效價高、少或無交叉反應性。與多抗相比，單抗純度高，專一性強、重復性好、且能持續地無限量供應。當前8頁，總共53頁。McAbandPcAb當前9頁，總共53頁。雜交瘤技術的誕生

1975年8月7日，Kohler和Milstein在英國《自然》雜志上發表了題為“分泌具有預定特異性抗體的融合細胞的持續培養”（Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity）1984年度榮獲諾貝爾生理學和醫學獎當前10頁，總共53頁。

一、雜交瘤技術的基本原理

聚乙二醇（PEG）：細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細

胞與小鼠骨髓瘤細胞融合

HAT培養基的選擇培養：反復的免疫學檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤

細胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤

細胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價的單克隆抗體當前11頁，總共53頁。抗體種類：第一代抗體多克隆抗體

（polyclonalantibody)第二代抗體單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體基因工程抗體（geneticengineeringantibody)當前12頁，總共53頁。B淋巴細胞:壽命短,分泌特異系性抗體骨髓瘤細胞：壽命長雜交瘤細胞：壽命長，單

隆抗體當前13頁，總共53頁。流程當前14頁，總共53頁。

不產生Ig的重鏈和輕鏈

HGPRT-（次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶）;TK-（胸腺嘧啶核苷激酶）

與提供淋巴細胞的動物品系相同（一）小鼠骨髓瘤細胞小鼠骨髓瘤細胞系均來源于BALB/c小鼠，大鼠骨髓瘤細胞都來源于LOU/c大鼠建立的骨髓瘤細胞系:SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653NSO/1當前15頁，總共53頁。

動物：BALB/c小鼠4～8周齡20g～25g體重（二）免疫脾細胞當前16頁，總共53頁。細胞性抗原：（1~2）×107/只，不加佐劑，2~3周重復一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加強免疫體內免疫法--免疫原性強、來源充分的抗原，對于免疫原性很弱或對機體有害（如引起免疫抑制）的抗原就不適用了免疫小鼠當前17頁，總共53頁。。淋巴細胞當前18頁，總共53頁。。漿細胞當前19頁，總共53頁。。抗原接種當前20頁，總共53頁。免疫原特性抗原量接種次數間隔時間單抗的特性抗體滴度親和性免疫原性強（如細胞、細菌和病毒等）106-107個細胞或1-10ug2-42-4周高中等至強免疫原性中等10-100ug2-42-4周中等或高中等或強免疫原性弱A.20-400ug2-4隨后2-3每月2-3月中等強B.10-50ug其后200-400ug2其后4每月每天中等中等C.10-100ug2其后4其后“休息”最后加強每月10天1-2月中等中等或強表6-1不同免疫抗原的免疫程序（引自劉秀梵，1994）

當前21頁，總共53頁。培養液：RPM1640培養液DMEM培養液（三）細胞融合當前22頁，總共53頁。細胞融合劑：PEG:分子量4000的PEG是最常用的細胞融合劑作用機理：誘導細胞膜上脂類物質結構重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合作用特點：隨機發生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同最早仙臺病毒被用做融合劑，后來發現聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染問題當前23頁，總共53頁。培養骨髓瘤細胞：選擇對數生長期的細胞進行傳代培養細胞形態：渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細胞返祖：定期用8-AG（8－氮鳥嘌呤）處理細胞，以維持HGPRT-的狀態。注意事項：切忌過多傳代培養，可將細胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中當前24頁，總共53頁。取已經免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清。同時通過頸脫位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5分鐘通常每只小鼠1×108-2.5×108個脾細胞，每只大鼠脾臟可得5×108-10×108脾細胞。免疫脾細胞的制備：1×108的淋巴細胞無菌手術當前25頁，總共53頁。常用的飼養細胞有胸腺細胞、正常脾細胞和腹腔巨噬細胞其中巨噬細胞還有清除死亡細胞的作用飼養存活一般不超過2周，不影響雜交瘤細胞的純化

在細胞融合后選擇性培養過程中，由于大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，這種被加入的活細胞稱為飼養細胞（Feedercells）。飼養細胞：當前26頁，總共53頁。。飼養細胞當前27頁，總共53頁。融合方法a、將1×108脾細胞與2×107-5×107骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中，補加不完全培養基至30ml，充分混勻。b、1000r/min離心5-10分鐘，將上清盡量吸凈。c、在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細胞松散均勻;置40℃水浴中預熱。d、用1ml吸管在1分鐘左右（最佳時間為45秒）加預熱至40℃的50%PEG（PH8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。e、用10ml吸管在90秒內加20-30ml預熱至37℃的不完全培養基；20-37℃靜置10分鐘。f、1000r/min5分鐘；棄去上清。g、加入5mlHAT培養基，輕輕吹吸沉淀細胞，使其懸浮并混勻，然后補加含腹腔巨噬細胞的HAT培養基至80-100ml。h、分裝96孔細胞培養板，每孔；分裝24孔板，每孔；然后將培養板置37℃，5%CO2培養箱內培養。i、5天后用HAT培養基換出1/2培養基。j、7-10天后用HT培養基換出HAT培養基；（第14天后可用普通完全培養基）。l、經常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。當前28頁，總共53頁。10～20天出現克隆HAT篩選雜交瘤細胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測。融合細胞的早期培養當前29頁，總共53頁。常用的抗體檢測方法：（1）免疫酶技術免疫酶技術是將抗原抗體反應的特異性和酶對底物顯色反應的高效催化作用有機結合而成的免疫學技術。由于它特異性高，靈敏度高，現已廣泛用于篩選和鑒定單抗。用可溶性抗原的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）用全菌抗原的ELISA用全細胞抗原的ELISA抗體捕捉ELISA試驗ABC-ELISA試驗Dot-ELISA試驗免疫組化染色法（2）免疫熒光技術間接免疫熒光法活細胞的膜熒光染色（3）間接血凝試驗（4）放射免疫測定當前30頁，總共53頁。HGPRT酶與TK酶：次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶胸腺嘧啶核苷激酶（四）雜交瘤細胞的選擇性培養應用液：8-氮鳥嘌呤當前31頁，總共53頁。HAT培養基：H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑（D途徑）

T（Thymidine）：胸腺嘧啶核苷酸；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNA。H和T聯合阻斷DNA合成的替代途徑。當前32頁，總共53頁。當前33頁，總共53頁。HAT選擇作用：淋巴細胞：不能生長，5~7天死亡。DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細胞：不能生長，5~7天死亡。HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑被阻斷當前34頁，總共53頁。SP2/O:HGPRT-，TK-;長命脾細胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)雜交瘤細胞:HGPRT+，TK+;長命骨髓瘤細胞、脾細胞與雜交瘤細胞當前35頁，總共53頁。雜交瘤細胞特點：長期生長繁殖利用淋巴細胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA從淋巴細胞獲得產生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力當前36頁，總共53頁。有限稀釋法(limitingdilution)

FACS法（fluorescenceactivatedcellsorter）軟瓊脂平板法(softagarmethod)

二、陽性雜交瘤細胞的克隆化培養與凍存當前37頁，總共53頁。特點：不需任何特殊設備克隆出現效率高實驗室常用方法方法：細胞懸液通過系列稀釋每個培養孔含0.5～1個細胞有限稀釋法每種雜交瘤細胞分裝96孔板一塊，每個稀釋度32孔，每孔量為0.2ml，每孔的雜交瘤細胞數分別為0.5、3和10。當前38頁，總共53頁。效率最高價格昂貴FACS（

FluorescenceActivatingCellSorter）當前39頁，總共53頁。軟瓊脂平板法(softagarmethod)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃5%CO2溫箱中培養10～14天克隆生長至2mm時，用毛細吸管吸出克隆，直接轉種于含有飼養細胞的24孔板，擴大培養。吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續克隆化，或擴大培養、凍存。當前40頁，總共53頁。配制方案：雜交瘤細胞（（1～5）x106/ml)+細胞凍存液(30%～40%牛血清，50%～60%RPMI-1640培養液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

保存數年至數十年“快融”：取出立即浸入37℃～40℃水浴中，使其迅速融化、復蘇雜交瘤細胞的凍存與復蘇在建立雜交瘤細胞的過程中，有時一次融合產生很多“陽性”孔，來不及對所有的雜交瘤細胞作進一步的工作，需要把其中一部分細胞凍存起來；另一方面，為了防止實驗室可能發生的意外事故當前41頁，總共53頁。防止污染避免染色體丟失防止非分泌細胞的過度生長防止細胞密度過高而死亡細胞冷凍的意義當前42頁，總共53頁。（1）單克隆性的確定

包括雜交瘤細胞的染色體分析、單抗免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型的鑒定和單抗純度鑒定等。A、雜交瘤細胞的染色體分析對雜交瘤細胞進行染色體分析可獲得其是否是真正的雜交瘤細胞的客觀指標之一，雜交瘤細胞的染色體數目應接近兩種親本細胞染色體數目的總和，正常小鼠脾細胞的染色體數目為40，小鼠骨髓瘤細胞SP2/0為62-68，NS-1為54-56；

B、單抗免疫球蛋白的類別和亞類鑒定

免疫擴散ELISAC、單抗純度的鑒定

聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、SDS、等電點聚焦電泳（IEF）及免疫

轉印分析（WB）等方法都可用于鑒定單抗的純度。PAGE、SDS、IEF、WB（三）單克隆抗體的性質鑒定當前43頁，總共53頁。（2）單抗理化特性的鑒定抗體親合力是指抗體與抗原或半抗原結合的程度，其高低主要是由抗體和抗原分子的大小、抗體分子結合簇（部）和抗原決定簇之間的立體構型的合適程度決定的。親合力通常以平均內在結合常數（K）表示。常用的方法有競爭ELISA、非競爭性ELISA 、間接ELISA、間接法夾心ELISA等（3）單抗與相應抗原的反應性測定包括各類免疫血清學試驗、生物學試驗和免疫化學技術等當前44頁，總共53頁。

三、單克隆抗體的制備

經過反復克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株應立即擴大培養（除及時凍存的細胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細胞產生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株制備單克隆抗體。當前45頁，總共53頁。（一）單克隆抗體的產生1動物體內誘生方法：每次用BALB/c或F1代小鼠，（5～10）×105/只,

使用的動物當然首選BALB/c小鼠,將雜交瘤細胞接種于小鼠腹腔內，在小鼠腹腔內生長雜交瘤，并產生腹水，因而可得到大量的腹