色譜分析在藥物分析中的運用第一頁，共二十六頁，2022年，8月28日1一、概述色譜學已發展成為一個獨立的學科醫藥領域是色譜應用的重要領域之一液相色譜目前在常規分析儀器中的排列第二頁，共二十六頁，2022年，8月28日2色譜學已發展成為

一個獨立的學科色譜作為分離分析學科，已有近一個世紀的發展過程。進入20世紀以來，科學技術有了飛速發展，色譜學已發展成為一個獨立學科，形成了薄層色譜、氣相色譜、液相色譜、離子色譜、超臨界流體色譜、親合色譜、疏水色譜、毛細管電泳和電色譜等許多分支。各種色譜儀與質譜，紅外核磁等技術聯用儀器已成為令人矚目的高新技術產品。第三頁，共二十六頁，2022年，8月28日3醫藥領域是色譜應用的

重要領域之一在藥物分析中，利用色譜分析方法顯得更為重要，尤其是高效液相色譜法（HPLC）是目前藥物分析中最常用的分析手段。它主要用于復雜成分、混合物的分離，即可用來作藥物的定性、定量及雜質檢查。由于高效液相色譜法分析樣品的范圍不受沸點、熱穩定性、相對分子質量大小及有機物與無機物的限制，使其應用范圍極廣。一般說來，只要能將樣品制成溶液，就可分析。且分離速度快，靈敏度高，色譜柱可反復使用，可選擇的流動相比氣相色譜法多。流出組分不被破壞，且容易收集，可在室溫下操作，絕大部分藥物均可用高效液相色譜法來作。第四頁，共二十六頁，2022年，8月28日4液相色譜目前在常規分析

儀器中的排列在2000年版一、二部藥典中，用高效液相色譜法測定的品種比1995年版藥典成倍地增加，2005年版一、二部藥典又增加幾倍。而高效液相色譜法在幾種儀器分析方法中，其分析數量的排列為第二，因其分離效率高，又能準確地反映所測成分的真實含量。中國藥典應用高效液相色譜法的情況，目前僅次于美國藥典，而優于英國藥典和日本藥局方。第五頁，共二十六頁，2022年，8月28日5二、共同探討高效液相色譜

在實際操作中的部分問題高效液相色譜方法的建立色譜分離類型的選擇溶劑的選擇溶劑純化溶劑的脫氣樣品溶劑的選擇檢測器的選擇系統適應性試驗無參比標準的純度評價HPLC在藥物分析中的應用范圍第六頁，共二十六頁，2022年，8月28日6高效液相色譜方法的建立應用HPLC對樣品進行分離、分析，主要根據樣品的性質，選擇合適的分離類型及所用的色譜柱和流動相、檢測器等。（一）樣品的性質樣品中待測組分的分子量大小、化學結構、溶解性等化學、物理性質決定著色譜分離類型的選擇。第七頁，共二十六頁，2022年，8月28日7色譜分離類型的選擇高效液相色譜的各種方法有其各自的特點和應用范圍，應根據分離分析的目的，樣品的性質和含量、現有的設備條件等選擇合適的方法。通常分離類型應根據樣品的性質（如相對分子質量的大小，化學結構，溶解性及極性等）來選擇，并根據此條件選擇色譜柱和流動相。第八頁，共二十六頁，2022年，8月28日8溶劑的選擇在高效液相色譜分析中，流動相的種類、配比，對色譜分離效果影響很大，可供選擇的固定相填料種類較少。因此，流動相的選擇顯得自關重要。（1）溶劑純度要高（2）不能引起柱效損失或保留特性變化（3）常用固定相與流動相的選擇（4）溶劑系統的選擇常用（5）緩沖系統及緩沖溶液的處理第九頁，共二十六頁，2022年，8月28日9溶劑純化在HPLC分離測定中，溶劑的純度是很關鍵的。溶劑足夠純才不至于產生問題，對溶劑純度的要求依應用情況而定。第十頁，共二十六頁，2022年，8月28日10溶劑的脫氣液相色譜儀的檢測器常被溶劑中的氣泡干擾，氣泡的形成是由于被空氣飽和的溶劑從高壓流向低壓，如柱出口，這些氣泡形成干擾檢測器光學道路的折射表面。因此，限制氣泡和伴隨的噪音的常用辦法是在用前從溶劑中除去氣泡。常用的脫氣方法有真空泵脫氣法和煮沸脫氣法。1．真空泵脫氣2．煮沸脫氣法3．溶劑的濾過第十一頁，共二十六頁，2022年，8月28日11樣品溶劑的選擇樣品的溶劑應對樣品溶解性大，且對樣品穩定并與檢測器相匹配，最好與流動相相同，這樣可允許大量的進樣量，但待測物的洗脫不應受影響，當樣品溶劑與流動相不同時，則會出現樣品溶劑的峰。第十二頁，共二十六頁，2022年，8月28日12第十三頁，共二十六頁，2022年，8月28日13緩沖溶劑的注意事項色譜柱使用的流動相pH值范圍為2.5～7.5為宜。酸性太強會使鍵合的烷基脫落，堿性太強會使硅膠溶解，通常用緩沖液維持一定的pH值。緩沖液濃度范圍為0.005～0.5mol/L，盡量用稀溶液為好，在用水和有機溶劑系統中，應注意鹽的存在會改變溶劑的可混合性，在色譜分離過程中，絕不能發生相的分離和鹽的沉淀。在HPLC中，最常用的緩沖溶液是醋酸鹽和磷酸鹽緩沖液。第十四頁，共二十六頁，2022年，8月28日14檢測器的選擇HPLC檢測中，當樣品有紫外吸收時，常選用紫外檢測器，在藥物分析文獻中，用紫外檢測器的占95%以上，使用時要注意溶劑的使用波長，即溶劑的極限波長必須低于檢測波長。若使用熒光檢測器或電化學檢測器，可使靈敏度提高2～3個數量級，但不是所有化合物都有熒光，無熒光的物質可經衍生化作用形成熒光的化合物。電化學檢測適用于有氧化還原性的藥物。第十五頁，共二十六頁，2022年，8月28日15系統適應性試驗當選用HPLC方法后，不同操作者各實驗室之間實驗數據的重現性應引起注意。在HPLC中，很難實現很好的重現性，因有許多具有相同名稱的填料，由于生產廠家不同，性質也不盡相同。有許多HPLC填料或柱隨著使用而變壞，其原因是填料的水解或柱死體積因填料溶解而增加，因此面臨著色譜柱是否與建立方法時的柱效相同的問題。當用HPLC方法時，系統要有合適的性能，系統性能受所用的色譜柱和溶劑的影響，通常用分離度，理論板數和峰拖尾因子等幾個基本參數來測定系統性能。第十六頁，共二十六頁，2022年，8月28日16峰形狀是用于控制系統適用性的另一色譜參數，監測峰形的重要方法之一是測定理論板數，但因用峰寬或半峰寬的計算不能表示峰是否拖尾，所以用于測量理論板數的方法并不標準，而在系統適用性試驗中，峰拖尾程度可以作為衡量柱效的另一指標，峰拖尾程度用拖尾因子表示。拖尾因子（T）定義為：式中W0.05h為0.05倍峰高處的峰寬；d1為峰的前沿到峰出現極大值時的水平距離，如圖。第十七頁，共二十六頁，2022年，8月28日17中國藥典2000年版和usp(24)均規定在峰高5%處測定峰寬。由于噪音及其他因素影響基線的穩定性峰高5%處的峰寬值易受其影響，從而干擾測定結果，有人在峰高10%處測定，重現性較好。峰拖尾程度對柱死體積和柱填料的變化很敏感，因此可作為衡量柱能否再用的標準。總之，柱性能是否處于良好水平，可使用關鍵的參數（如校正線的斜率，理論板數和峰拖尾程度來衡量。當這些參數超過允許范圍時，就不應再用此柱進行實驗。第十八頁，共二十六頁，2022年，8月28日18無參比標準的純度評價HPLC已成為鑒定藥物純度的主要工具，用于鑒別和檢查樣品中的雜質，首先要求分離完全，為此要選擇合適的色譜條件將雜質、降解產物與主分分離，評價雜質的主要問題是雜質的定量，可在相同的色譜條件下將雜質的峰面積與已知濃度的對照品的峰面積進行比較，但通常雜質是未知的，因此為測定樣品中未知雜質的濃度，就需要做一些假設。第十九頁，共二十六頁，2022年，8月28日19HPLC在藥物分析中的應用范圍

HPLC法在藥物分析中常用于藥物的鑒別和檢查1、利用已知物對照法定性2、色譜法與其他方法結合定性（1）利用化學反應定性（2）利用二極管陣列檢測器來測定各組分的紫外吸收光譜。（3）收集峰的流出物，經濃縮蒸除溶劑，進行IR.MS和NMR鑒別。（4）液-質聯用儀3、定性分析第二十頁，共二十六頁，2022年，8月28日20定性分析1、利用已知物對照法定性2、利用保留特性3、色譜法與其他方法結合定性（1）利用化學反應定性（2）利用二極管陣列檢測器來測定各組分的紫外吸收光譜。（3）收集峰的流出物，經濃縮蒸除溶劑，進行IR.MS和NMR鑒別。（4）液-質聯用儀第二十一頁，共二十六頁，2022年，8月28日21定量分析1、校正因子2、定量分析方法的種類（1）峰面積歸一化法（2）外標法（3）內標法第二十二頁，共二十六頁，2022年，8月28日22三、微柱色譜實用性進展微柱液相色譜法與普通液相色譜法的比較微柱液相色譜的應用范圍第二十三頁，共二十六頁，2022年，8月28日23微柱液相色譜法的實用性進展微柱液相色譜法與普通液相色譜的比較分類應用快速藥物分析在藥物分析中，復方制劑分析和治療藥物監測非常適合用微柱，進行快速分析。分析APC片中的3種主藥，用100mm×1mm微柱，填充3μm的ODS，用乙腈-5mmol/L辛基磺酸鈉溶液（18:20）為流動相，20s內分離即完畢，50個樣品15min內即完成。流動相只需14ml，為常規柱的1/21。第二十四頁，共二十六頁，2022年，8月28日24微柱液相色譜法的實用性進展微柱液相色譜法與普通液相色譜的比較分類應用快速藥物分析在藥物分析中，復方制劑分析和治療藥物