聚合酶鏈反應又稱體外DNA擴增技術。是利用耐熱DNA聚合酶的反復作用，通過變性-退火-延伸循環操作，在體外特異地擴增所需要的DNA片段的一種技術。它能快速將皮克(pg)水平的DNA特異地擴增100萬倍左右，達到微克(g)水平。優點：敏感度高、特異性強、產率高、重復性好以及快速簡便等。當前1頁，總共104頁。在分子生物學、基因工程研究，以及遺傳病、傳染病和惡性腫瘤等基因診斷和研究中得到廣泛應用。并已普及到許多普通實驗室，大大簡化了傳統的分子克隆技術，便于對目的基因進行分析、鑒定。當前2頁，總共104頁。目的基因載體復制子宿主細胞擴增擴增提取DNA分子當前3頁，總共104頁。

通常的DNA擴增法是分子克隆法,首先要構建含有目的的基因的載體,然后將它導入細胞后進行擴增,還要用同位索探針進行篩選;要經過DNA內切、連接、轉化和培養等相關的過程，操作復雜,一般需要數周時間。當前4頁，總共104頁。70年代的初期由Dr.H.Klenow發現了較具有實驗價值及實用性的KlenowfragmentofE.Coli；1976年從溫泉中的細菌（Thermusaquaticus）分離出來的Taqpolymerase，它的特性能耐高溫。80年代之后它被廣泛運用；1983年美國Mullis等人發明了聚合酶鏈反應方法；1985年美國PE-Cetus公司開發出了具有應用價值的PCR技術；1987年引入了耐高溫的DNA聚合酶，從而使PCR成為一項成熟的技術，而迅速在世界各地推廣。1993年Mullis也因此獲得了諾貝爾化學獎。PCR技術的發現當前5頁，總共104頁。KaryBMullis

(1944-)

1983年提出PCR方法

1993年度諾貝爾化學獎當前6頁，總共104頁。一、PCR基本原理PCR是一項DNA體外合成技術，類似于生物體內的DNA復制過程。依據DNA半保留復制的機理。PCR合成DNA比細胞內復制過程簡單。第一節PCR技術的原理和特點當前7頁，總共104頁。細胞內復制的過程1）細胞內有關蛋白質參與下，DNA雙螺旋解鏈成兩條單鏈，各自作為模板。2）引物酶以兩條單鏈為模板各自合成一段引物，引物提供3’-OH末端。3）DNA聚合酶以親代DNA單鏈為模板，以dNTP為原料，按照堿基配對的原則，從引物的3’端，循5’→3’方向，將脫氧核苷酸聚合，最終形成子代的DNA雙鏈。當前8頁，總共104頁。Denaturing95?CAnnealingTm-5?CExtension72?CPCR的原理當前9頁，總共104頁。PCR的基本過程1.變性：將反應體系升溫至95℃左右，樣品中雙鏈DNA解開成兩條單鏈，各自作為模板（待拷貝的DNA稱為模板）

。2.退火：將溫度降至引物的Tm值以下(55℃左右)，5’端和3’端的引物各自與兩條單鏈DNA模板的互補區域結合。5’5’3’3’編碼鏈3’端引物5’端引物3’3’當前10頁，總共104頁。3.延伸：將溫度升到75℃左右，耐熱的TaqDNA聚合酶催化四種

dNTP，從引物3’-OH端開始，依據模板堿基序列互補方式依次聚合，合成一條互補的DNA鏈。5’5’3’3’5’DNA聚合酶5’當前11頁，總共104頁。Cycle355

5555555

5

55555

525～30次循環后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。當前12頁，總共104頁。PCR的擴增效應理論上，每增加1個循環，雙鏈DNA片段會增加1倍，使DNA量可成指數(2n)增加。實際上，擴增效應低于指數增加，約為(1+X)n。一般進行30個左右的循環，特定區域的DNA量可至少增加106倍。當前13頁，總共104頁。PCR產物的積累規律PCR反應初期，目的DNA片段的增加呈指數擴增。隨著目的DNA擴增產物的逐漸積累，酶的催化反應趨于飽和，此時DNA擴增產物的增幅減慢，即出現“平臺效應”。到達平臺期所需要的循環次數一般在30次循環之后。當前14頁，總共104頁。瓊脂糖凝膠電泳PCR產物的鑒定、提取當前15頁，總共104頁。

PCR

DNA復制部位：DNA體外合成放大過程生物體內DNA合成引物：DNA引物RNA引物（作為新鏈的一部分）（復制終止時被切除）催化酶：TaqDNA聚合酶DNA聚合酶有5’→3’核酸外切酶有5’→3’核酸外切酶無3’→5’核酸外切酶有3’→5’核酸外切酶基本過程：每循環一次包括復制起始、鏈延伸和變性、退火、延伸終止三階段反應實質：擴增靶DNA合成子代DNA當前16頁，總共104頁。PCR儀聚合酶鏈反應中的變性、退火、延伸的溫度和時間，以及循環次數，是由具有程控的快速升溫和快速降溫裝置的PCR儀控制。當前17頁，總共104頁。當前18頁，總共104頁。當前19頁，總共104頁。PCR儀越快，越精確，越昂貴當前20頁，總共104頁。ABI7500實時熒光定量PCR儀

普通梯度PCR儀當前21頁，總共104頁。當前22頁，總共104頁。二、PCR技術的特點1.高度的敏感性：可將極微量(pg)DNA，擴增到紫外光可見的水平(ug)，這是最主要的特點，它可對單拷貝基因、單個細胞、單根頭發、一滴血等微量標本進行分析。當前23頁，總共104頁。2.高度的特異性：PCR擴增的特異性由兩個引物的序列決定，因此引物設計至關重要。①引物與模板DNA特異正確的結合；

②遵循堿基配對原則；

③TaqDNA聚合酶合成反應的忠實性；④靶基因的特異性與保守性。當前24頁，總共104頁。引物引物引物的序列及其與模板結合的特異性是決定PCR反應結果的關鍵。引物設計的原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。基因組當前25頁，總共104頁。3.適用樣品的廣泛性：

對樣品的要求并不十分嚴格：

1)可以是DNA，也可以是RNA

2)可以是純化的，也可以是粗制的3)可以是新鮮組織，也可以是陳舊組織4)可以是細胞，也可以是體液4.

操作簡便、快速：PCR自動化，數小時完成。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

當前26頁，總共104頁。三、參與PCR反應體系

的因素及其作用模板引物TaqDNA聚合酶dNTPMg2+緩沖液反應溫度循環次數PCR儀等

PCR體系當前27頁，總共104頁。（一）模板—核酸

1.模板：指能擴增靶DNA片段的核酸2.DNA是直接模板，RNA是間接模板

RNA樣品必須先經過逆轉錄生成cDNA，cDNA作為PCR擴增的模板。這個技術稱為逆轉錄PCR（RT-PCR）。當前28頁，總共104頁。病原體標本：有病毒、細菌、真菌、螺旋體、立克次體、支原體等。病理生理標本：有細胞、血液、絨毛、羊水細胞、尿液、上皮細胞、體外培養細胞系。法醫學標本：有血斑、精斑、毛發等。考古標本：殘留有核酸物質3.常見的擴增對象(含核酸的標本)：當前29頁，總共104頁。4.避免有影響擴增反應的物質存在如：核酸酶：降解DNA、RAN

蛋白酶：降解TaqDNA聚合酶血紅素、抗凝劑：抑制TaqDNA聚合酶活性理論上，要獲得最好的特異性及忠實性的擴增只向反應體系中加入單一拷貝的靶序列DNA作為模板。

當前30頁，總共104頁。人基因組DNA0.1-1μg大腸桿菌基因組DNA10-100ngλDNA0.5-5ng質粒DNA0.1-10ng5.模板量要合適，一般為102~105拷貝。50μlPCR反應體系中模板DNA推薦使用量當前31頁，總共104頁。（二）引物1）引物：2條人工合成的、能與模板DNA互補結合的脫氧寡核苷酸。1.引物的性質和作用當前32頁，總共104頁。2）引物的序列：根據欲擴增的DNA片段兩端序列而設計的。5’端引物：與模板鏈的5’端序列相同；3’端引物：與模板鏈的3’端序列互補。5’5’3’3’模板鏈3’端引物5’端引物3’3’當前33頁，總共104頁。3)

引物決定PCR擴增產物的特異性和

長度。4)引物設計決定PCR反應的成敗。特異性：引物只針對DNA的一個特定序列互補結合，因此2條引物與DNA模板特異性結合決定了要擴增的DNA區域。長度：2條引物分別互補于所要擴增DNA片段的兩端，使DNA片段的擴增只限于引物之間的部位。當前34頁，總共104頁。2.引物設計的基本要求1）引物長度要合適，一般為16～30個核苷酸，常用20bp左右。引物過短：會影響PCR的特異性；增加一個核苷酸，特異性提高4倍引物過長：需提高相應的退火溫度，若超過延伸溫度即TaqDNA酶的最適溫度，則影響PCR反應產物。當前35頁，總共104頁。2）G+C含量一般占50％～60％，有利于引物與模板的結合。GC太少擴增效果不佳，GC過多易出現非特異條帶。3）ATCG4種堿基隨機分布，避免連續出現3個以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，最好隨機分布。否則易使引物與模板的嘌呤或嘧啶密集區發生錯配。4）引物內部不能存在互補序列，以避免形成發夾結構。5）兩個引物之間不能存在互補序列，以避免形成引物二聚體。當前36頁，總共104頁。6）引物與非特異性序列的同源性不能超過70%或不能有連續8個堿基互補，否則導致非特異性擴增。7）引物3’末端堿基一定要與模板正確配對，引物3’端最佳堿基選擇是G和C。8）引物的5’端可以修飾，如：引入酶切位點、啟動子序列、用熒光素、生物素等標記等9）引物擴增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。當前37頁，總共104頁。5’限制性內切酶的識別序列啟動子序列定點突變探針標記引物3’端為關鍵堿基；5’端無嚴格限制。3’3’5’GC當前38頁，總共104頁。3.引物的使用要求

引物濃度要遠高于模板濃度，一般每條引物的濃度0.1～0.5μmol，以最低引物量產生所需要的結果為好。引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

合適的退火溫度比引物本身的Tm低5℃，一般在55℃左右。當前39頁，總共104頁。（三）TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶是從一種水生棲嗜熱菌YT1株(一種嗜熱真菌)分離提取出來，該酶基因全長2.49kb，編碼832個氨基酸。該酶雖然在90℃以上幾乎無DNA合成，但確有良好的熱穩定性。（天然酶）另一類通過基因工程合成的酶。（基因工程酶）TaqDNA聚合酶的熱穩定性是該酶用于PCR反應的前提條件，也是PCR反應能迅速發展和廣泛應用的原因。當前40頁，總共104頁。(一)酶活性與熱穩定性1）酶蛋白分子量94KDa，比活性200000∪/mg，Taq酶的濃度通常為1~2.5∪/l，太多浪費并易導致非特異性擴增。

2）熱穩定性好：能耐受DNA變性時的高溫在92.5℃、95℃、97.5℃時，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分別經130min、40min、5min后，仍可保持50%的活性。PCR反應時變性溫度為95℃～20sec，50個循環后，TaqDNA聚合酶仍有65%的活性。當前41頁，總共104頁。1）TaqDNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，對Mg2+濃度非常敏感。2）Mg2+濃度2.0mmol/L時，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。3）Mg2+能與dNTP結合而降低PCR反應液中游離的Mg2+濃度，優化濃度一般反應中Mg2+濃度至少應比dNTP總濃度高0.5～1.0mmol/L。4）適當濃度的KCl能使TaqDNA聚合酶的催化活性提高50～60%。(二)離子依賴性當前42頁，總共104頁。1）TaqDNA聚合酶具有5′→3′聚合酶活性和5′→3ˊ外切酶活性，而無3′→5′外切活性，在PCR反應中如發生某些堿基的錯配，該酶是沒有校正功能。TaqDNA聚合酶的堿基錯配機率為2.1×10-4。2）TaqDNA聚合酶還具有逆轉錄酶活性,溫度一般為65～68℃。(三)低保真性(四)Taq酶的最適溫度75~80℃每個酶分子可延伸約150個核苷酸/秒，70℃延伸率大于60個核苷酸/秒，55℃時為22個核苷酸/秒。最適溫度75℃左右。當前43頁，總共104頁。當前44頁，總共104頁。（四）原料原料：四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)：濃度為20~200μmol/L。Mg2+：為Taq酶的必需激活劑。

濃度為0.5~2.5mmol/L。太少：酶活性明顯降低；

太多：導致非特異性擴增。（五）Mg2+當前45頁，總共104頁。反應溫度和時間1.變性：

95℃，30”~1’雙鏈DNA變成單鏈。2.退火：55℃，30”~1’引物與模板互補結合。退火溫度對特異性影響很大。退火溫度=Tm值-(5～10℃)Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T）3.延伸：72~75℃，1’~2’Taq酶催化dNTP，從引物3’-OH端開始，與模板互補，合成一條新的DNA鏈。小于20bp片段當前46頁，總共104頁。反應緩沖液：常用10mmol/LTris-HCl緩沖液，pH8.3~8.8為Taq酶最適pH值。循環次數：主要取決于模板DNA的起始濃度，合適的循環數為25~30次。

循環數太少：產物量不多循環數太多：非特異性擴增會增加，出現平臺效應當前47頁，總共104頁。PCR反應體系5×擴增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加雙蒸水至50ul當前48頁，總共104頁。四、PCR常見問題1.無擴增產物模板:含有抑制物，含量低Buffer對樣品不合適引物設計不當或者發生降解反應條件：退火溫度太低延伸時間太短

原因對策純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量更換Buffer或調整濃度重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一管新引物提高退火溫度、延長延伸時間現象：對照組有條帶，而樣品則無；當前49頁，總共104頁。2.非特異性擴增現象：PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。當前50頁，總共104頁。引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高循環次數過多

原因對策重新設計引物適當降低模板或引物濃度適當減少酶量降低Mg2+濃度減少循環次數非特異性擴增當前51頁，總共104頁。3.拖尾

現象：產物在凝膠上呈拖尾狀態。M12當前52頁，總共104頁。模板不純引物的特異不強降解退火溫度偏低酶量過多dNTP、Mg2+濃度偏高循環次數過多電泳體系的問題

原因對策純化模板重新設計引物改變條件適當提高退火溫度減少酶量或更換酶適當降低dNTP和Mg2+的濃度觀察marker是否也存在拖尾現象

拖尾當前53頁，總共104頁。4.假陽性原因：靶序列或擴增產物的交叉污染，引物設計不當。

現象：空白對照出現目的擴增產物

對策：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。

當前54頁，總共104頁。五、PCR實驗注意事項由于PCR的靈敏性極高，故微量的樣品污染便可導致假陽性結果的出現。所有的溶液都應該沒有核酸和核酸酶的污染采取的措施：1）隔離不同的操作區2）采用一次性用具3）嚴格按無菌操作原則進行4）并設置嚴格的對照，以提高PCR結果的正確性。當前55頁，總共104頁。除實驗樣品外，應設幾種實驗對照：1）陽性對照：陽性DNA模板參與的PCR反應；陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好，經各種鑒定是該產物的標本。2）陰性對照：無核酸模板參與的PCR反應；在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以檢測試劑是否污染。

當前56頁，總共104頁。示例電泳結果

12345MM：DNAmarker1：為陽性對照2：為陰性對照3-5：為擴增出的DNA條帶當前57頁，總共104頁。DNA片段基因診斷基因治療基因工程產品法醫學檢測人類學研究……六、PCR技術的主要用途PCR當前58頁，總共104頁。利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板獲得已知目的基因片段,或與逆轉錄反應相結合，直接以組織和細胞的mRNA為模板獲得目的片段。1.目的基因的克隆當前59頁，總共104頁。大腸桿菌胰島素重組體+胰島素基因基因工程產品當前60頁，總共104頁。A’內源性病變基因正常人(+)A病人(-)病原微生物基因正常人(-)病人(+)2.基因檢測當前61頁，總共104頁。遺傳病的診斷

基因缺失、插入或置換等地中海貧血珠蛋白鏈合成障礙，或珠蛋白的組分改變，功能降低當前62頁，總共104頁。A正常人病人正常病人當前63頁，總共104頁。ASO探針法病人ACTGASO探針正常PCR-ASO檢測基因點突變：利用PCR技術擴增靶基因的適當片段，再用人工合成的含突變位點標記的寡核苷酸探針雜交直接檢測突變點當前64頁，總共104頁。探針雜交NC膜探針正常人突變純合子突變雜合子當前65頁，總共104頁。PCR-RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism限制性片段長度多態體）法：

限制性核酸內切酶惡性腫瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因當前66頁，總共104頁。突變限制性核酸內切酶當前67頁，總共104頁。正常突變電泳當前68頁，總共104頁。3.DNA和RNA的微量分析PCR技術高度敏感，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。

當前69頁，總共104頁。PCR后將待測DNA片段既可克隆到特定的載體進行序列測定，也可直接測定。PCR技術引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；使用引物對靶序列進行擴增，就可摻入同位素或非同位素標記的各種堿基，獲得所需比活性的探針。4.DNA序列測定5.用PCR標記DNA探針當前70頁，總共104頁。mRNA

第二節常用幾種PCR反應1)RNase2)堿性液(水解RNA)

單鏈DNA逆轉錄酶

(使dNTP聚合)RNA-DNA雜化鏈PCR一、逆轉錄PCRDNA聚合酶雙鏈DNA(使dNTP聚合)PCR當前71頁，總共104頁。二、實時PCR實時PCR（real-time

polymerase

chain

reaction）又稱熒光定量PCR。在PCR反應體系中加入熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

當前72頁，總共104頁。熒光定量PCR儀是一種帶有激發光源和熒光信號檢測系統的PCR儀，通常配有電腦系統及相應的分析軟件。實時PCR(real-timePCR)技術通過動態監測反應過程中的產物量，消除了產物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR，得到廣泛應用。熒光定量PCR標記方法：序列特異性探針：如 Taqman內摻式染料：如SYBRGreenI當前73頁，總共104頁。PCR引物實時PCR技術原理當前74頁，總共104頁。引物之間一段帶有標記寡核苷酸鏈，稱作探針當前75頁，總共104頁。報告基團淬滅基團當前76頁，總共104頁。無熒光信號產生能量激發光完整的探針：5′端熒光基團吸收能量后將能量轉移給臨近的3′端熒光淬滅基團（發生熒光共振能量轉移）

當前77頁，總共104頁。變性(95oC)當前78頁，總共104頁。退火(60oC)當前79頁，總共104頁。退火(60oC)當前80頁，總共104頁。當前81頁，總共104頁。當前82頁，總共104頁。?當前83頁，總共104頁。5′→3′外切酶活性將探針5′端連接的熒光基團從探針上切割下來當前84頁，總共104頁。當前85頁，總共104頁。當前86頁，總共104頁。當前87頁，總共104頁。當前88頁，總共104頁。當前89頁，總共104頁。當前90頁，總共104頁。當前91頁，總共104頁。當前92頁，總共104頁。當前93頁，總共104頁。當前94頁，總共104頁。實時PCR技術原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光標記分子RQ3'3'5'5'熒光報告分子熒光淬滅分子熒