第三部分細胞工程演示文稿當前1頁，總共62頁。優選第三部分細胞工程當前2頁，總共62頁。31、植物組織培養：

用無菌方法，使植物體的離體器官、組織和細胞在人為提供的條件下生長和發育的培養技術的總稱。2、外植體：

由活植物體上切取下來以進行培養的那部分組織或器官。一、植物組織培養中的幾個基本概念當前3頁，總共62頁。43、植株培養：

以具備完整植株形態的材料（如幼苗和較大的植株）為外植體的無菌培養。4、胚胎培養：

以從胚珠中分離出來的成熟或未成熟胚為外植體的離體無菌培養。當前4頁，總共62頁。55、器官培養：

以植物的根、莖、葉、花、果等器官為外植體的離體無菌培養。6、組織培養：

以分離出植物各部位的組織（如分生組織形成層、木質部、韌皮部、表皮、皮層、胚乳組織、薄壁組織、髓部等），或已誘導的愈傷組織為外植體的離體無菌培養。當前5頁，總共62頁。二、細胞工程的分類根據研究對象的不同：61）植物細胞工程

2）動物細胞工程

3）微生物細胞工程當前6頁，總共62頁。7植物細胞工程包括：植物組織、器官培養技術；細胞培養技術；原生質體融合與培養技術；亞細胞水平的操作技術等。當前7頁，總共62頁。8動物細胞工程包括：

細胞培養技術（包括組織培養、器官培養）；胚胎工程技術（核移植、胚胎分割等）；

克隆技術（單細胞系克隆、器官克隆、個體克隆）；細胞融合技術。當前8頁，總共62頁。91997年2月，英國科學家Wilmut等在世界權威雜志《Nature》上首例報道了世界第一只克隆羊的誕生。當前9頁，總共62頁。10多莉羊的培育過程卵細胞Ａ母綿羊Ｂ母綿羊乳腺細胞細胞質細胞核細胞核移植早期胚胎卵裂C母綿羊子宮胚胎移植多莉羊分娩妊娠融合后的卵細胞當前10頁，總共62頁。11第一節細胞培養的設備

和操作技術1、實驗室的設計

2、基本操作技術

3、培養基及其配制當前11頁，總共62頁。12一、實驗室的設計當前12頁，總共62頁。13

細胞工程實驗室它必須滿足三個基本的需要，即：實驗準備（培養基配制，洗滌與滅菌）；無菌操作；控制培養。當前13頁，總共62頁。14從總體上來分，實驗室主要分為兩類：基本實驗室：輔助實驗室：實驗室設計當前14頁，總共62頁。151、基本實驗室：準備室接種室培養室當前15頁，總共62頁。16

作用

植物細胞和組織培養所需器具的洗滌、干燥和保存；培養基的配制、分裝和滅菌；化學試劑的配制；重蒸餾水的生產等。

設計要求

面積20m2左右。通風透光，地面防滑，墻面防潮。準備室當前16頁，總共62頁。17▲實驗臺架▲大、小水槽▲烘箱▲冰箱▲天平系列▲

pH計▲高壓消毒鍋▲各種玻璃器皿▲藥品柜▲（磁力）攪拌器▲電爐▲蒸餾水器

設備當前17頁，總共62頁。18接種室

——也叫無菌操作室作用

供外植體的接種，培養物的轉移和原生質體的游離培養操作之用。當前18頁，總共62頁。19無菌室當前19頁，總共62頁。20設計要求

墻壁光滑平整，地面平坦無縫，除出入口和通氣口外，應當密閉，空氣不能對流，或者空氣經凈化后進入室內。無菌室旁邊應設有緩沖間，緩沖間內應有紫外燈，隨時可進行滅菌。當前20頁，總共62頁。21

無菌室內的日常滅菌：定期用甲醛和高錳酸鉀混合后熏蒸，產生大量蒸汽，殺滅微生物。

使用前處理：用新潔爾滅（1：50）擦凈，然后用紫外燈照射滅菌至少20分鐘，操作前用70%酒精噴霧。當前21頁，總共62頁。22設備△紫外光燈△空調△放物架（或醫用小平車：推送、放置培養基用；）△無菌操作用的器具：酒精燈、70%酒精消毒棉、解剖刀、弓背鑷子、解剖針、剪刀等。當前22頁，總共62頁。23△超凈工作臺：內設紫外燈、吹風裝置、過濾裝置等每次實驗前要用紫外燈滅菌20分鐘以上，然后噴酒精滅菌，工作過程中注意一直開著吹風機，并且一定要關掉紫外燈，過濾網應經常清洗。當前23頁，總共62頁。24其它部件：△離心機：分離原生質體用；△點融合儀：細胞融合用。當前24頁，總共62頁。253培養室當前25頁，總共62頁。26

離體組織和試管苗生長發育的場所，應為培養物創造適宜的溫、光、氣等條件。設計要求

培養室內要求內壁保溫、光滑、室頂高2.6m左右，易于控制溫、濕度，窗上要求裝雙層密封玻璃窗，室內有足夠電源。

作用當前26頁，總共62頁。27設備△

空調機：冷暖型△

加熱器△

定時裝置：控制光照時間△

培養架：放置培養瓶△

搖床和轉床：懸浮培養△

各種光質燈管：光照培養△

溫度計：控制溫度△

遮光簾：供暗培養之用當前27頁，總共62頁。282、輔助實驗室：細胞學實驗室攝影室及暗室生化分析室當前28頁，總共62頁。29細胞學實驗室主要設備

各種顯微鏡，顯微照相設備，切片、制片儀器設備，染色用具，暗房設備等。

作用

植物組織和細胞培養過程中，需隨時觀察記錄其細胞學和形態解剖學的變化，故要設置細胞顯微觀察室。當前29頁，總共62頁。30當前30頁，總共62頁。31理化分析試驗室當前31頁，總共62頁。32二、基本操作技術當前32頁，總共62頁。33

基本操作技術主要是圍繞無菌操作技術展開的一系列操作技能，內容主要包括：一．洗滌技術二．滅菌、消毒技術三、培養基配置技術四、接種技術當前33頁，總共62頁。34（一）、洗滌技術、洗滌目的：去除雜物，降低帶菌量、根據洗滌對象的不同，主要分為：器皿洗滌（包括玻璃、塑料、搪瓷、不銹鋼器皿）培養材料洗滌當前34頁，總共62頁。35

一）器皿洗滌根據洗滌對象的具體情況可分為以下三種：特殊洗滌微生物大量污染的洗滌常規洗滌當前35頁，總共62頁。36

常規洗滌△

自來水洗去油漬、霉菌等臟物；△溫肥皂水中浸泡一定時間后用刷子刷凈；△自來水沖洗干凈，至瓶壁不掛水珠為止；△蒸餾水淋洗內外壁△將玻璃器皿倒置：晾干或烘干（50～75℃）△放入除塵柜中備用當前36頁，總共62頁。37

微生物大量污染的洗滌△

微生物污染器皿加壓滅菌后再洗滌特殊洗滌（如沾有蛋白質類物質或其它有機物時)△

經過常規洗滌未過蒸餾水的器具，浸泡入洗液（鉻酸洗滌液是用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)與硫酸(H2SO4)配制而成）中數分至數小時；△

回收洗液，器具先用自來水洗凈，蒸餾水淋洗，烘干（75℃）當前37頁，總共62頁。38

二）、試驗材料的清洗

清洗目的：來自自然界的試驗材料，包括來自土壤中的幼莖、磷莖，滋生著各種微生物，尤其是細菌的芽孢和真菌的孢子，一旦與培養基接觸，就會很快的繁殖起來，造成培養基和培養材料的污染。

清洗方法：先用自來水沖洗5分鐘，然后用中性洗滌劑清洗，注意勿損傷試驗材料。再用自來水流水沖洗半小時，用于下一步的藥劑滅菌。當前38頁，總共62頁。39（二）、滅菌、消毒技術

一）關于有菌和無菌的概念有菌的范疇：

凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的，如植物的表面、超凈工作臺的臺面，未處理的工具和手等。當前39頁，總共62頁。40

高壓高溫處理（工具、器皿、培養基等）物理或化學處理；火烤后的物體；健康的動植物不與內外部表面接觸的組織內部可能是無菌的（有時也有內生菌，但不會影響培養，也不會污染）無菌的范疇：當前40頁，總共62頁。41

二）滅菌、消毒技術作用和意義

植物組培中，凡用于培養和無菌操作的房間、器具、培養瓶、培養基，培養材料和操作者的衣物和手都應隨時進行滅菌，以確保不受雜菌污染，否則，由于雜菌的生長繁殖速度一般都比培養的組織快得多，最終將把組織全部殺死，這些污染微生物還可能排泄對植物組織有毒的代謝廢物，因此在培養容器內部保持一個完全無菌的環境是絕對必須的。當前41頁，總共62頁。42

三）滅菌、消毒種類物理方法：

物理滅菌：高溫高壓滅菌（干熱/濕熱）、烘烤或灼燒滅菌、射線處理、超聲波等

物理除菌：過濾（0.25微米）、離心沉淀等；化學方法：使用滅菌劑，如薰蒸滅菌、消毒液滅菌（酒精、升汞、苯酚、漂白精、新潔爾滅、次氯酸鈉、過氧化氫）當前42頁，總共62頁。43消毒、滅菌的對象：

★接種室

★材料（外植體）：★器皿用具消毒（滅菌）★培養基當前43頁，總共62頁。44

四）、培養基、器具的滅菌

用滅菌鍋滅菌：一般121℃，滅菌20分鐘。自動鍋：加足水后，調好時間、溫度、即可自動運轉。

手動鍋：加足水后，關好，通電。待壓力升到0.5kg／C㎡時，打開排氣閥排除鍋內的冷空氣。然后關閉排氣閥，升至1.1kg／C㎡(121℃左右)時計時，用通電、斷電來保持20分鐘。后斷電待壓力降至時取出。

器具的滅菌：也可用烘箱160℃，90～120分鐘當前44頁，總共62頁。45

五）、過濾除菌培養基的滅菌一般用高壓高溫處理，但如果培養基中某些成分遇到高溫分解（如某些激素GA3、玉米素等），就需要過濾滅菌或者兩者結合。另外酶等也需要過濾滅菌；

滅菌方法：將激素或酶配成一定濃度，用注射器過慮，0.2－0.25微米。配制培養基時，先將培養基高壓滅菌，待溫度降至50℃左右時，加入適量的已過慮除菌的激素等，然后分裝。當前45頁，總共62頁。46

六）、外植體的消毒：

取材將老的組織去掉自來水沖洗清潔劑水洗（簡單殺菌）自來水沖洗

70％酒精處理消毒劑處理滅菌蒸餾水沖洗3－5遍。

消毒時間，因材料老嫩程度不同有所不同。一般，較老的材料相對殺菌時間較長，反之，較短。一般殺菌，酒精10秒，升汞5－12分鐘。當前46頁，總共62頁。47消毒劑

使用濃度(％)消毒時間(分)效果殘液去除難易次氯酸鈣105～30好易次氯酸鈉

2～55～30好易新潔爾滅10～205～30好易氯化汞

0.1～12～10最好最難過氧化氫10～125～15較好最易抗菌素4～50mg/L30～60較好較難幾種常用消毒劑的效果比較當前47頁，總共62頁。48根據離體培養的營養需求，培養基至少包括：

無機鹽；

有機化合物；

生長調節劑（三）、培養基及其配制當前48頁，總共62頁。49一）、培養基的基本成分Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、B1無機營養物質、大量元素：C、H、ON、P、K、Ca、Mg、S、(Na)、微量元素：當前49頁，總共62頁。50無機鹽的作用：一是組成各種化合物，參與機體的建造，成為結構物質；二是構成一些特殊的生理活性物質，如植物激素、酶以及酶的活化劑，參與植物的代謝活動；三是這些元素之間相互協調，以維持離子濃度平衡、膠體穩定、電荷平衡等生物電化學方面的作用；四是在發育過程中，影響組織器官的建成。當前50頁，總共62頁。51濃度：2%-3%2有機物質糖：作用：維持培養基合適的滲透壓為細胞提供合成新物質的碳骨架為細胞的呼吸代謝提供底物和能量種類：蔗糖、葡萄糖麥芽糖、果糖等多糖：可溶性淀粉當前51頁，總共62頁。52生理活性物質維生素：

種類：硫胺素(VB1)、煙酸（VB3）、泛酸(VB5)、吡哆醇(VB6)、酸銨、鈷胺素(VB12)、葉酸(VM又稱VB11)、抗壞血酸(VC)等.作用：利于細胞代謝和器官分化。B1是植物組培必須加入的維生素，其用量在0.1-30mg/L之間，當組培中細胞分裂素特別少時，B1更為需要；煙酸和B6可促進細胞生長。當前52頁，總共62頁。533、生長調節劑（激素）

在培養基中，其各種成分對培養物影響最大的最顯著的就是激素。激素的種類、濃度、以及配比都會顯著的影響愈傷組織的形成、不定根、不定芽的分化，胚狀體的形成等；

組織培養中使用的激素有的是天然的，如脫落酸（ABA）等，有的是合成的，如二氯苯氧乙酸（2，4－D）。當前53頁，總共62頁。54生長調節劑種類1、生長素2、細胞分裂素3、赤霉素:GA34、脫落酸：ABA5、其它：如乙烯當前54頁，總共62頁。55常用的生長素有：

二氯苯氧乙酸（2，4－D）

；

萘乙酸（NAA）

吲哚乙酸（

IAA）

；

吲哚－3－丁酸（IBA）

萘氧乙酸（NOA）

；

對氯苯氧乙酸（P-CPA）

三氯苯氧乙酸（2，4，5－T）；

生根粉（ABT）如：NAA、IAA、

IBA易引起生根，

2，4－D、2，4，5－T有利于愈傷組織的誘導和生長。當前55頁，總共62頁。56主要作用：是誘導愈傷組織的形成、胚狀體的產生以及試管苗的生根，更重要的是配合一定比例的細胞分裂素誘導腋芽及不定芽的產生；作用的強弱順序為：

2，4-D>NAA>IBA>IAA當前56頁，總共62頁。57常用的細胞分裂素有：

6－芐基嘌呤（BAP）；

6－芐基腺嘌呤（6－BA）；

激動素（呋喃氨基嘌呤、Kinetin、KT）；

玉米素（ZT）；

異戊烯氨基嘌呤（2－IP）

噻二唑苯基脲（thidiazuron、TDZ）；

溶解方法：0.1MHCL

保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存當前57頁，總共62頁。58主要作用：促進細胞的分裂和器官的分化、延緩組織的衰老