目的基因的獲取演示文稿當前1頁，總共36頁。1、什么是目的基因2、目的基因獲取途徑3、PCR法制備方法及過程當前2頁，總共36頁。一、什么是目的基因目的基因：是指基因工程操作中需要的外源基因，它是編碼某種蛋白質的結構基因，如生物的抗逆性基因、抗蟲基因等。從目的基因的概念來看，最原始的目的基因是指從某甲種生物體內直接獲得，然后轉入已知的某乙種生物體內并讓其成功表達以使乙種生物能表現甲種生物的某種特征的基因。當前3頁，總共36頁。需要克隆的DNA片段編碼某種蛋白質研究某基因結構和功能的關系研究某基因與疾病的關系當前4頁，總共36頁。二、目的基因的獲取化學合成法基因組DNA文庫;cDNA文庫聚合酶鏈式反應直接從染色體DNA中分離當前5頁，總共36頁。三、PCR擴增獲得目的基因當前6頁，總共36頁。1、PCR的含義聚合酶鏈式反應PolymeaseChainReaction(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應組成一個周期,循環進行,使目的DNA得以迅速擴增,具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。當前7頁，總共36頁。PCR可以把

指定的基因片段

幾何放大染色體PCR

基因放大連瑣反應當前8頁，總共36頁。2、PCR的基本原理試管中進行的DNA復制反應，依據DNA半保留復制的機理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復性的性質；通過人為控制體外合成系統的溫度，使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。當前9頁，總共36頁。3、PCR的反應過程1）、預變性：使模板DNA的二級結構充分打開，讓DNA雙鏈充分解離,為了第一次退火過程時候引物可以盡量多的結合到模板上面。

一般的PCR反應的預變性溫度是94℃或95℃，預變性時間一般設為3-5min。當前10頁，總共36頁。2）、變性：使DNA雙鏈解離變為單鏈。一般94℃～95℃，1min足以使模板變性若低于94℃則需延長時間但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。當前11頁，總共36頁。3)、退火(復性)：使引物結合在模板上。退火溫度是影響PCR特異性的重要因素。退火溫度，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基因序列的長度，一般在40-65℃之間。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃作為選擇最適退火溫度的起點較為理想。當前12頁，總共36頁。引物的復性溫度的計算公式Tm（解鏈溫度）＝4(G+C)+2(A+T)復性溫度=Tm值－（5～10℃）；在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性；復性時間一般為30～60s，足以使引物與模板之間完全結合。當前13頁，總共36頁。4）、延伸：在DNA聚合酶的催化下，按照堿基互補配對原則不斷合成DNA片段。延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。延伸反應時間：根據待擴增片段長度而定1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴增10kb需延伸至15min延伸時間過長會導致非特異性擴增對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些當前14頁，總共36頁。4、PCR的反應過程演示當前15頁，總共36頁。當前16頁，總共36頁。當前17頁，總共36頁。當前18頁，總共36頁。當前19頁，總共36頁。當前20頁，總共36頁。當前21頁，總共36頁。當前22頁，總共36頁。當前23頁，總共36頁。當前24頁，總共36頁。當前25頁，總共36頁。當前26頁，總共36頁。當前27頁，總共36頁。當前28頁，總共36頁。5、PCR法克隆基因的技術流程設計引物提取基因組DNA進行電泳檢測進行PCR反應當前29頁，總共36頁。5.1設計引物引物設計的原則：（1）序列應位于高度保守區，與非擴增區無同源序列。（2）引物長度以15-40bp為宜。（3）堿基盡可能隨機分布，G+C占50-60%。（4）引物內部避免形成二級結構。（5）兩引物間避免有互補序列。當前30頁，總共36頁。（6）引物3’端的堿基要求嚴格配對（不能做任何修飾），5’端無嚴格限制。（7）引物5′端可修飾引物5′端限定著PCR產物的長度，但對擴增特異性影響不大；引物5′端堿基可不與模板DNA互補而呈游離狀態；引物5′端最多可加10個堿基而對PCR反應無影響。當前31頁，總共36頁。限制性內切酶的識別序列啟動子序列定點突變探針標記3’5’3’5’當前32頁，總共36頁。5.2提取基因組DNA模板DNA的來源：微生物中提取DNA植物中提取DNA從細胞中提取DNA：血細胞、絨毛、尿樣、毛發、精斑、口腔上皮細胞固定和包埋的組織標本：脫蠟、蛋白酶K消化模板DNA的濃度：0.1～2ug/100ul體系PCR產量隨模板DNA濃度的增加而顯著升高模板DNA濃度過高導致非特異性產物增加當前33頁，總共36頁。5、3進行PCR反應當前34頁，總共36頁。5、4PCR反應體系與流程反應體系模板（DNA或RNA）引物TaqDNA聚合酶10×PCR緩沖液1.5～4mMMg2+0.2mMdNTP反應流程預變性變性