醫學免疫學檢驗-免疫熒光技術課件篇一：免疫熒光技術簡介免疫熒光技術簡介技術支持|瀏覽次數：416|時間：2022-2-22PriCells-免疫熒光技術(Immunofluorescencetechnique)1941年，Coons等于首次采用熒光素進行標記而獲得成功。這種以熒光物質標記抗體而進行抗原定位的技術稱為熒光抗體技術(fluorescentantibodytechnique)。該技術的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較復雜。一、熒光免疫技術的概念：免疫熒光技術(Immunofluorescencetechnique)又稱熒光抗體技術,是標記免疫技術中發展最早的一種。將抗原或抗體用熒光素進行標記，標記的抗原或標記的抗體與相應的抗體或抗原反應后，測定復合物中的熒光素，這種免疫技術稱為免疫熒光素技術。免疫熒光細胞化學分直接法、夾心法、間接法和補體法。二、熒光免疫技術分類：熒光抗體顯微鏡技術：抗原抗體反應后，利用熒光顯微鏡判定結果的檢測方法。2）免疫熒光測定技術：抗原抗體反應后，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法三、熒光的產生：物質吸收外界能量而進入激發狀態，在回復基態時多余的能量以電磁輻射的形式釋放，即發光，這種光稱為熒光。這種物質，稱為熒光素。由光激發所引起的熒光，為光致熒光；由化學反應所引起的熒光，為化學熒光。四、熒光素的熒光特性：（1）停止供能，熒光現象隨即終止（2）對光的吸收和熒光的發射具高度選擇性入射光波長＜發射光波長（3）熒光效率：熒光效率=發射熒光的光量子數/吸收光的光量子數（4）熒光猝滅現象：熒光素的輻射能力減弱五、常見熒光素：（1）異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）:FITC純品為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構體，其中異構體I型在效率、穩定性與蛋白質結合力等方面都更優良。FITC分子量為389.4,最大吸收光波長為490?495nm，最大發射光波長為520?530nm，呈現明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應用最廣泛的熒光素。其主要優點是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明(rhodamine,RB200)：RB200為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質穩定，可長期保存。最大吸收光波長為570nm，最大發射光波長為595~600nm，呈現橘紅色熒光。四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamineisothiocynate,TRITC)：TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩定。最大吸收光波長為550nm，最大發射光波長為620nm，呈現橙紅色熒光，與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或對比染色。因其熒光淬滅慢，也可用于單獨標記染色。鑭系：鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪(Eu3)、鋱(Tb3)、鈰(Ce3)等的螯合物經激發后也可發射特征性的熒光，其中以Eu3應用最廣。Eu3螯合物的激發光波長范圍寬，發射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，最適合用于分辨熒光免疫測定。藻紅蛋白(P-phycoerythrin，PE)：PE是在紅藻中所發現的一種可進行光合作用的自然熒光色素，分子量為240kD的蛋白，最大吸收峰為564nm，當使用488nm激光激發時其發射熒光峰值約為576nm，對于單激光器的流式細胞儀來說，推薦使用585±21nm的帶通濾光片，雙激光器的流式細胞儀推薦使用575±13nm的帶通濾光片。FL2探測器檢測PE。多甲藻葉綠素蛋白(peridininchlorophyllprotein，PerCP)PerCP是在甲藻和薄甲藻的光學合成器中發現的，是一種蛋白復合物，分子量約為35kD，最大激發波長的峰值在490nm附近，當被488nm氬離子激光激發后，發射光的峰值約為677nm。FL3探測器檢測PerCP。碘化丙啶(propidiumiodide，PI):可選擇性地嵌入核酸(DNA、RNA)的雙螺旋堿基對中。在對DNA染色時，需用RNase對細胞進行處理，以排除RNA對DNA熒光定量精度的影響。在488nm波長激發下，PI的發射光譜為610-620nm。FL2探測器檢測PI。常見熒光素的特性：FITC:黃色結晶粉末，吸收光：490~495nm，發射光：520~530nm，明亮的黃綠色熒光。RB200:橘紅色粉末，吸收光570nm，發射光595~600nm，橘紅色熒光。TRITC:紫紅色粉末，吸收550nm，發射光620nm，橙紅色熒光。鑭系：Eu、TbPE：吸收光490?560nm，發射光595nm，紅色熒光。其它：酶作用后產生熒光物質。酶作用后產生熒光物質：酶底物產物激發光發射光B-GMUGMU360450APMUPMU360450HRPHPA二聚體317414酶作用后產生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經酶作用便形成具有強熒光的物質。例如，4-甲基傘酮-B-D半乳糖苷受B-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發出熒光，激發光波長為360nm發射光波長為450nm。其他如堿性磷酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）等的螯合物可發射特征性的熒光，而且激發光波長范圍寬、發射光波長范圍窄、熒光衰變時間長，最適合于時間分辨熒光免疫測定。六、合適熒光素的選擇：（1）具有與蛋白質形成共價鍵的化學基團。（2）熒光效率高，標記后下降不明顯。（3）熒光色澤與背景色澤對比鮮明。（4）標記后能保持生物學活性和免疫活性（5）標記方法簡單、快速。（6）安全無毒篇二：醫學免疫學CDC實驗CDC實驗一.實驗原理細胞表面抗原與相應的抗體（IgGl~3或IgM）特異性結合形成的免疫復合物，可通過經典途徑激活補體形成攻膜復合體而導致細胞膜穿孔。因此，水溶性染料如臺盼藍可進入受損細胞，染成藍色，為陽性反應；不帶抗原的細胞，未損傷，不染色，為陰性反應。二.實驗步驟1.胸腺細胞懸液制備頸椎脫臼法處死小鼠/暴露胸腔，分離出胸腺/鑷子夾住胸腺反復輕輕研磨（單個細胞PBS洗2次，1000rpm,10min(加入5%小牛血清PBS制備細胞懸液調節細胞濃度至3-4X107/ml結果判斷細胞膜穿孔的細胞呈藍色，細胞膜完整的活細胞不著色。②細胞毒性作用的判斷標準如下：陰性反應(－)死細胞占0-10%可疑陽性反應(±)死細胞占11-20%弱陽性反應(+)死細胞占21-50%陽性反應(++)死細胞占51-80%強陽性反應(+++)死細胞占81-100%結果記錄表格記錄照片展示討論.第①組成陽性的原因：實驗中加入抗原、抗體、補體、LC。抗原抗體能形成抗原抗體免疫復合物，通過經典途徑激活補體，形成攻膜復合物，從而導致細胞膜穿孔，細胞受損，臺盼藍進入細胞，染成藍色，呈陽性反應。說明CDC實驗必須要有抗原、抗體、補體共同參與。.第②組成陰性的原因：實驗中加入抗體、LC。因為無抗原和補體,不能形成抗原抗體免疫復合物，也無補體，因此不能形成攻膜復合物，不能使細胞膜穿孔，細胞無損傷，臺盼藍無法進入細胞，不能被染成藍色，呈陰性反應。說明CDC實驗必須要有補體的參與。.第③組呈陰性的原因：試驗中加入LC和補體，因為無抗原抗體，所以沒有抗原抗體免疫復合物的形成，補體不能被激活，不能形成攻膜復合物，細胞無受損，臺盼藍不能進入而不被染色，呈陰性反應。說明CDC實驗必須要有抗原、抗體的參與。.第④組呈陰性的原因：實驗中只加入LC,既無抗原抗體免疫復合物的形成，也無補體，細胞無受損，臺盼藍不能進入而不被染色，呈陰性反應。說明CDC實驗必須要有抗原、抗體、補體的共同參與。篇三：免疫學診斷技術免疫學診斷技術軍事醫學科學院附屬醫院陳建魁主要內容：第一節第二節第三節第四節第五節第六節抗原抗體反應免疫學檢測常用標記技術免疫細胞的檢測免疫分子的檢測免疫相關基因的檢測免疫學檢測方法的應用第一節抗原抗體反應抗原抗體反應:抗原與相應抗體在體內或體外發生的特異性結合反應應用已知抗體或抗原檢測未知抗原或抗體，可以對感染性、非感染性致病因子或疾病相關因子進行診斷或輔助診斷。1、特異性2、適合比例性3、可逆性抗原抗體反應的特異性：一種抗原一般只能與由它刺激所產生的抗體結合，這種抗原抗體結合反應的專一性即特異性?？乖贵w結合力的大小，常用親和力(affinity)或親合力(avidity)來表示。親和力是指抗體分子上一個抗原結合部位與相應的抗原決定基之間的結合強度。親合力是指整個抗體分子與整個抗原之間的結合強度。適合比例性：抗體含量抗原含量前帶等價帶后帶在抗原抗體特異性反應時，當抗原與抗體達到最適比例時，沉淀物形成最多。如果抗原或抗體極度過剩則無沉淀物形成，這種現象稱為帶現象出現在抗體過量時，稱為前帶。在抗原過量時，稱為后帶。抗體過剩抗原抗體比例合適抗原過剩網格學說(latticetheory)可逆性：Ag+AbK(親和常數)二AgAb抗原抗體反應的影響因素1、電解質濃度2、酸堿度（pH:6?8）3、溫度（37?42°C）抗原抗體反應類型：根據抗原性質、出現結果的現象、參與反應成分的不同，可將抗原抗體反應分為：凝集反應沉淀反應補體參加的反應采用標記物的抗原抗體反應等顆粒性抗原（細菌、紅細胞等）與相應抗體結合后形成凝集團塊，這一類反應稱為凝集反應（agglutination）。該類反應可檢測到ug/ml水平的抗體。直接凝集反應細菌或紅細胞等顆粒性抗原抗體正向間接凝集反應載體顆粒可溶性抗原例如，用Y球蛋白包被的膠乳顆粒,檢測病人血清中的抗人Y球蛋白的抗體（類風濕因子）。反向間接凝集反應載體顆粒抗體可溶性抗原可溶性抗原(如：血清蛋白質、細胞裂解液等)與相應抗體結合后出現沉淀物，此類反應稱為沉淀反應(precipitation)。液相沉淀反應絮狀沉淀反應環狀沉淀反應抗血清抗原+―抗原抗體+―免疫比濁法：在定量抗體中分別加入不同濃度的抗原，經一定時間后可形成免疫復合物。用濁度計測量反應液體的濁度，復合物形成越多，濁度越高，可根據標準曲線計算出樣品中的抗原含量。該法快速簡便，可取代免疫擴散法測定Ig含量。凝膠內沉淀反應免疫擴散技術免疫電泳技術火箭電泳單向擴散試驗對流電泳雙向擴散試驗免疫電泳AgAbAg第二節免疫學檢測常用的標記技術免疫標記技術(immunolabellingtechnique)是指用熒光素、放射性核素、酶、發光劑或電子致密物質(膠體金、鐵蛋白)作為示蹤劑標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應。此類方法具有靈敏、特異、快速，能夠定性、定量甚至定位測定，結果易于觀察、適合自動化檢測等很多優點。廣泛用于各種生物活性物質的分析鑒定與定量檢測。根據標記物與檢測方法不同，標記技術可分為:免疫熒光技術放射免疫測定免疫酶標技術發光免疫分析免疫金標記技術主要的免疫標記物類別熒光素標記物FITC、藻紅蛋白（PE）用途免疫組化免疫分析測定放射性核素酶3H、51Cr、32P、125I、131I免疫分析測定免疫組化免疫分析測定HRP、AP化學發光物Luminol金屬顆粒膠體金免疫分析測定免疫組化免疫分析測定用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待檢標本中的抗原反應，抗原抗體復合物散發熒光，借此對標本中的抗原作鑒定和定位。（一）免疫熒光顯微技術1直接熒光法：將熒光素直接標記抗體，作標本染色。優點:簡便易行。缺點:每檢查一種抗原必須制備相應的熒光抗體。2間接熒光法：首先用一抗與標本中的抗原結合，再用熒光素標記的二抗染色。優點:敏感性高，制備一種熒光素標記的二抗可用于多種抗原的檢查。缺點：非特異性熒光容易增多。3補體結合免疫熒光法行示蹤。在抗原-抗體反應時加入補體，使之與抗原-抗體復合物結合；再用熒光素標記的抗補體抗體進直接法間接法補體法雙標記法流式細胞術(flowcytometry,FCM)免疫熒光技術應用于流式細胞儀,可對細胞的表面標志(抗原或受體)進行快速、精確的分析和自動檢測,并可將不同類型的細胞分選收集。FCM還可對同一細胞的多種參數(如DNA、RNA、蛋白質和細胞體積等)進行多信息分析,是生命科學研究領域廣泛應用的一項新技術。熒光免疫測定(fluoroimmunoassay，FIA)1.熒光偏振免疫測定：(fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA)熒光物質經偏振光藍光照射而躍入激發態，在恢復至基態后可釋放出光子，經偏振儀形成偏振光，測定其強度可得到樣品中待測物質的濃度主要用于小分子物質(特別是藥物濃度)的測定。酶聯熒光免疫測定(enzymelinkedfluoro-immunoassay，ELFIA)應用具有潛在熒光的物質作為酶的底物，經過酶解反應