關于分子細胞遺傳學技術與產前診斷第1頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三基因診斷的中心問題是認識遺傳變異、基因突變及與表型之間的關系第2頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三一、分子細胞遺傳學技術第3頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三熒光原位雜交技術（fluorescenceinsitehybridization,FISH）：用熒光物質標記特異性DNA探針，與中期細胞染色體或間期細胞核雜交，鑒別和確定出生缺陷、腫瘤細胞染色體異常，分辨率可達50－500kb.第4頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三熒光原位雜交技術（Fluorescenceinsitehybridization,FISH）的特異性DNA探針基因座特異性探針：克隆擴增獲得。在基因制圖方面的努力，越來越多的這方面探針可以使用著絲粒重復序列探針：這些特異性的探針可在中期染色體和間期細胞核中產生強烈信號，可以鑒別特異性染色體。全染色體涂染探針：通過對來自特異性染色體分檢庫或僅含一條人類染色體的雜種細胞DNA擴增制備。這種DNA序列的混合物與一條染色體上的多個位點同源。因此在中期核內，整條染色體得以被涂染。通過使用不同的熒光素，在一個中期染色體涂片上可以鑒別幾條不同的染色體。第5頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三應用15號染色體一基因特異性探針（紅色）雜交確定其是否缺失；綠色探針鑒定15號染色體著絲粒。24種不同染色體涂染探針雜交得到的彩色染色體第6頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三染色體技術的應用－1inv(14)(p12q24)t(2;11)(2q34;11q13)第7頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三細胞遺傳學研究中染色體技術的應用—FISH技術檢出t(2;14)第8頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三染色體技術的應用－2inv(9)(p12q13)第9頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三分子細胞遺傳學：DMD基因第46號外顯子缺失第10頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三細胞遺傳學研究中染色體技術的應用9號染色體涂染探針雜交。箭頭示易位到10號染色體上的來自9號染色體的片段21號染色體涂染探針FISH雜交，顯示21三體第11頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三比較基因組雜交（comparativegenomichybridization,CGH）近年在FISH技術基礎上發展起來的一種新的分子細胞遺傳學技術（1992，Kallioniemi）。其基本原理是用不同熒光物質分別標記腫瘤細胞DNA和正常人細胞DNA，然后與正常人中期細胞染色體雜交。通過檢測染色體上兩種熒光信號的相對比值，了解腫瘤細胞DNA拷貝數的變化，并可在染色體上定位。這一技術已廣泛應用于腫瘤基因組不平衡的檢測。第12頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三比較基因組雜交的原理第13頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三待測DNA（腫瘤細胞DNA，testDNA)為綠色參照DNA(正常細胞DNA，referenceDNA）為紅色復染為藍色人食管鱗癌細胞株的比較基因組雜交第14頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三中期染色體的DAPI的復染圖B.中期染色體比較基因組雜交（CGH）：紅色區域表示丟失，綠色區域表示擴增。第15頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三CGH的優點：經一次染色體原位雜交實驗即可在整條染色體或染色體區帶水平對待檢基因組DNA序列拷貝數改變進行檢測和定位。無需進行染色體培養，對于不易制備良好分裂相的實體瘤尤為適用。所需染色體DNA可來自各種組織，如新鮮組織、福爾馬林固定的組織、石蠟包埋組織，可在很少量的基礎上檢測，利于做回顧性研究。第16頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三CGH的局限性：難以檢出以下異常：平衡易位，微小突變，基因重排，倍體水平改變。結果可能受到一些因素影響：正常細胞存在，腫瘤自身的遺傳異質性，系統的波動。靈敏度：限于檢測較大范圍的缺失（10—30MB）第17頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三二、突變分析與分子診斷第18頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三（一）基因突變類型點突變：只有一個或幾個核苷酸的改變，是突變中最多見的形式。穩定突變：傳遞中不改變原有的突變。動態突變：傳遞中不斷改變自己，多見于短重復序列的突變，在一代代傳遞中重復次數發生明顯變化。

第19頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三點突變的結果：（1）同義突變（samesensemutation）：堿基替換后，雖然密碼子發生改變，但編碼氨基酸沒有改變（遺傳密碼的兼并性），亦稱靜止突變。（2）錯義突變（missensemutation）：堿基替換，密碼子發生改變后，編碼氨基酸亦發生改變，編碼另一個氨基酸。（3）無義突變（nonsensemutation）：堿基替換后，使編碼氨基酸的密碼子變成一個終止密碼子。（4）中性突變：包含兩種情況，即“同義突變”和不改變蛋白質功能的“錯義突變”第20頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三基因突變形式—堿基的插入和缺失堿基的插入和缺失：基因編碼序列中插入或丟失一個或幾個堿基，其結果是突變點下游堿基序列發生移碼，編碼氨基酸序列都發生改變，又稱移碼突變（frameshiftmutation），并可在突變點下游提前出現終止密碼。第21頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三堿基的插入和缺失的結果：將導致移碼突變（frameshiftmutation），并可在突變點下游提前出現終止密碼產生截短型蛋白缺失突變第22頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三基因突變形式框內突變（inframemutation）：3個或是的倍數的堿基缺失或插入導致的突變，使基因丟失或增加1個或幾個氨基酸。DNA大片段缺失或復制（largedeletionorduplication)：幾百個bp至幾十個kb的堿基缺失或復制。第23頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三各種類型病理性突變的比例無義突變和移碼突變：60％稀有的錯義突變：20％DNA大片段缺失或重復:20％另外：可能和疾病風險評估有關的大量的多態位點微小突變第24頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三（二）目前常用的對已知點突變的分析技術限制性片段長度多態性（RFLP）等位基因特異性（PCR）擴增（ASA）等位基因特異性寡核苷酸雜交（

ASO）DNA芯片第25頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三1.限制性片段長度多態性（RFLP）分析當突變影響到某一限制性內切酶位點時，可通過酶切PCR產物，電泳分析:限制性片段長度多態性（RFLP）第26頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三2.等位基因特異性（PCR）擴增（ASA）通過設計兩個5’端引物，一個與正常DNA互補，一個與突變DNA互補。分別加入這兩種引物及3’端引物進行兩個平行的PCR，分析結果。第27頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三3.等位基因特異性寡核苷酸雜交（

ASO）設計兩段寡核苷酸探針，其中包含發生突變的位點，一段與野生型鏈互補，一段與突變型鏈互補。雜交分析是否存在突變第28頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三4.基因芯片：SNP位點的檢測第29頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三Microarray-basedmethodforgenotypingoffunctionalsinglenucleotidepolymorphismsusingdual-colorfluorescencehybridization.MutatRes.2004;548:97-105第30頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三（三）目前常用的未知基因突變分析技術異源雙鏈體形成分析（Heteroduplexanalysis,HA）單鏈構象多態性分析（Single-strandconformationanalysis,SSCP）變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE）變性高效液相色譜分析（Denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC）第31頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三體外蛋白截短實驗（Proteintruncationtest,PTT）定量多重PCR技術（QuantitativemultiplexPCR,QM-PCR）多重探針連接依賴性擴增技術（MultiplexLigation-dependentProbeAmplifcation,MLPA)DNA序列分析（DNAsequencing)第32頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三1.異源雙鏈體形成分析（HA）由突變型和野生型DNA鏈形成的異源雙鏈DNA在其錯配處形成一個凸起，電泳時會產生與相應的同源雙鏈DNA不同的遷移率，從而使兩者得以分離。技術路線：PCR產物95C變性5分鐘，37C復性10分鐘。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（0.2%硝酸銀染色）第33頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三2.變性梯度凝膠電泳（DGGE）利用不同DNA序列開始變性時對變性劑濃度的要求不同，在變性劑濃度梯度凝膠內電泳，野生型DNA和突變型DNA序列的差異所導致其變性點不同使兩者的電泳遷移率出現差異第34頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三3.單鏈構象多態性分析（SSCP）單鏈DNA在中性條件下會形成二級結構。這種二級結構依賴于其堿基的序列。即使只有一個堿基的不同，也會形成不同的二級結構并可引起非變性條件下的電泳遷移率的差異。技術路線：PCR產物95C變性5分鐘，立即置冰上。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。條件：電泳緩沖液0.5TBE，電壓70v,4C環境下電泳過夜（0.2%硝酸銀染色）。第35頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三4.體外蛋白截短試驗（PTT）從蛋白質水平檢測基因的突變。其原理是堿基缺失和插入導致的移碼突變、堿基替換出現的無義突變均可使基因提前出現終止密碼，從而截短mRNA翻譯的蛋白質。技術路線：血細胞RNAcDNART-PCR體外蛋白質合成電泳分析截短了的蛋白質相應基因片段的序列分析第36頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三上游引物5’端均連接T7啟動子序列GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATGG[35S]甲硫氨酸，T7體外轉錄/翻譯體系（兔網織紅細胞提取物），30℃孵育90min，完成體外蛋白質合成。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳第37頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三5.變性高效液相色譜分析（DHPLC）1995年OefnerandUnderhill首次報道DHPLC技術。其原理是在接近DNA融解溫度條件下進行離子對反相高效液相色譜分析。DHPLC分析突變的原理：在DNA部分變性的條件下，變異型和野生型DNA可形成同源雙鏈和異源雙鏈．根據其在層析柱上保留的時間可以分辨出變異性型DNA.第38頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三用離子對反相高效液相色譜檢測DNA變異是基于同時存在同源雙鏈和異源雙鏈。異源雙鏈的檢出取決于高效液相色譜的溫度。而色譜溫度的選定與野生型DNA融解溫度（Tm）有關。DHPLC與其它突變分析技術的比較:對單個核苷酸變異的檢出率:SSCP技術,約75%；DHPLC,>90%.第39頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三DHPLC的優點：靈敏，準確；分析速度快，單個樣本的分析時間僅需幾分鐘；容易實現自動化操作；適用于較大樣本中基因突變的篩選。第40頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三DHPLC分析：（野生型）第41頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三DHPLC分析:突變型（單個堿基改變）第42頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三DHPLC分析:突變型（單個堿基改變）第43頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三6.定量多重PCR技術（QuantitativemultiplexPCR，Q-M-PCR）目前各實驗室普遍采用的突變基因分析技術對基因微小突變的檢測具有較高的敏感性，如對單個堿基改變的檢出率可達90%以上。但對于較大的DNA缺失或DNA重復產生的突變，如以外顯子為單位的DNA缺失，SSCP、DHPLC等均難以將其檢出。有資料表明大片段DNA缺失可占基因突變的三分之一第44頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三定量多重PCR技術要點：涉及至少2個基因的多個外顯子在一個反應管內同時進行PCR擴增，其中一個外顯子作為參照外顯子，其余作為檢測外顯子；控制PCR循環數，使PCR產物的增加處于對數增長曲線內；PCR產物于DNA測序儀電泳，其結果經GeneScan軟件處理；第45頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三以檢測外顯子PCR產物與參照外顯子PCR產物的比值計算模版DNA相對拷貝數，確定是否存在檢測外顯子的雜合性缺失；檢出的缺失經其它方法（長片段PCR或缺失斷裂點測序）確認。第46頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三7.MultiplexLigation-dependentProbeAmplifcation—MLPADenaturedgenomicDNAishybridizedwithamixtureofmorethan40probes.EachMLPAprobeconsistsoftwooligonucleotides,onesyntheticandoneM13-derived.Thetwopartofhybridizedprobesareligated.AllprobeligationproductsareamplifiedbyPCRusingonlyoneprimerpair.ElectrophoresisofPCRproductsonDNASequencerinGeneScanmodel.第47頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三三、遺傳性疾病的診斷第48頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三遺傳性疾病的診斷：（一）臨癥診斷（二）癥狀出現前的診斷（三）產前診斷第49頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三（一）臨癥診斷根據就診患者的臨床表現作出（初步）判斷：疾病診斷，遺傳方式（1）癥狀、體征（2）系譜分析部分遺傳性疾病的診斷主要依賴于癥狀、體征對于同時存在散發病例和遺傳性病例的復雜性疾病，如腫瘤，建立相應的臨床可疑病例的判定標準根據不同的遺傳性疾病，選擇適當的實驗室技術分析確診：生化技術、細胞技術、分子技術多用于對先證者的診斷第50頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三Pedigreeofafamily第51頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三遺傳性疾病基因診斷程序臨床診斷和確定分析對象確定分析的目標基因以檢測目標基因的結構確定分析的技術構成和分析過程：基因微小變異篩查：SSCP,DGGE,DHPLC,PTT,DNA測序分析基因大片段變異（缺失或重復）的分析檢出變異的性質評估和患者家族的遺傳咨詢。

第52頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三DHPLC突變分析第53頁，共62頁，2023年，2月20日，星期三體外蛋白截短試驗

（PTT）—HNPCC遺傳性突變第54頁，共62頁，2023年，