第六節藥物的抗病毒試驗一、目的和要求1.駕馭藥物體外抗病毒的試驗方法和操作步驟。2.熟悉病毒感染性動物模型的建立和評價。二、內容（一）原理病毒是一類結構簡潔、非細胞形態的專性細胞內寄生的微生物，必需在易感的活的動物、雞胚或細胞內才能進行復制增殖。因此可用動物、雞胚或細胞來進行病毒培育和藥物的抗病毒試驗。可通過視察細胞培育液酸堿度的變更、病毒致細胞病變效應（CPE）、病毒滴度（PFU）變更、病毒基因組mRNA水平變更、雞胚尿囊液或動物血清等相應指標的變更，來推斷藥物的抗病毒試驗效果。（二）材料1.9~10d日齡雞胚，殼白凈且厚薄勻整的雞卵（萊亨雞的受精卵由于卵殼薄，在孵育過程中便于檢查，為首選）2.Hep-2細胞或MDCK細胞3.病毒：如IFV（FM1株）、RSV（Long株）4.藥物：試驗藥物，陽性比照藥5.動物：小鼠等（三）操作方法 雞胚培育為常用的病毒培育法之一，目前主要用于痘類病毒、粘病毒、皰疹病毒的分別、鑒定、制備抗原和疫苗的生產等。1.接種方法 病毒的雞胚培育法主要有四種接種途徑，即尿囊腔、絨毛尿囊膜、羊膜腔和卵黃囊，不同的病毒應選擇各自適宜的接種途徑，并依據接種途徑確定雞胚的孵育日齡（見表）。下面將以流感病毒為例進行說明。一）雞胚法

表6-1

雞胚孵育日齡及接種途徑選擇接種病毒名稱接種部位雞胚日齡收獲材料痘類病毒、單純皰疹病毒絨毛尿囊膜9-10絨毛尿囊膜流感病毒、腮腺炎病毒尿囊腔9-11尿囊液流感病毒初次分離羊膜腔12-14羊水某些嗜神經性病毒卵黃囊5-6卵黃液2.IFV-FM1的50%雞胚感染量（EID50）測定用生理鹽水將病毒作10倍系列稀釋，分別接種雞胚，0.1ml/胚，同時設正常比照，共6組，每組5胚。35℃孵育72h，置4℃冰箱過夜，收集尿囊液做血凝試驗，按Reed-Muench法計算FM1的EID50。3.藥物對雞胚的毒性作用選用健康的9~11日齡雞胚，消毒備用。將受試藥和比照藥作10倍系列稀釋5~6個濃度，如100mg/ml、10mg/ml、1mg/ml、100μg/ml、10μg/ml，每個濃度接種5胚，0.25ml/胚。35℃培育5d后視察結果（死亡/存活）。確定兩種藥物對雞胚的最大無毒劑量（TC0），用于正式試驗。4.藥物對FM1的抑制作用雞胚隨機分為14組，每組5胚，即試驗藥的六個劑量組（從TC0起先作10倍系列稀釋）、陽性比照藥六個劑量組（同前）、生理鹽水和病毒比照組。將不同濃度的藥液注入雞胚中，0.25ml/胚，30min后經相同途徑注入100EID50病毒0.1ml，比照組以生理鹽水代替。35℃溫箱孵育5d。收獲尿囊液，測其血凝效價，以能抑制32倍以上所注射的最小藥物量，即為其最小抑制劑量（MIC）。4.1雞胚接種（1）孵育9~10d左右的雞胚，在照蛋燈下用蠟筆標出氣室和胎位。（2）雞胚直立于固定架上，氣室端向上，按常規以碘酒，酒精消毒。（3）用磨蛋器在氣室中心磨一小孔，再用碘酒擦拭。（4）用lml注射器吸取病毒懸液，針頭從氣室小孔刺入，沿胚胎的長軸刺入0.5~1.0cm深度；此時針頭已在尿囊腔中，注入0.2ml病毒懸液。（5）拔出針頭，用鑷子將膠布沾酒精燒灼后將小孔封閉，置于35~36℃溫箱內培育二天，每天翻動兩次，用照蛋燈檢視一次。培育二天后。置-20℃冰箱2h后，無菌操作收獲尿囊液。4.2尿囊液的收獲（1）從冰箱中取出雞胚，用碘酒，酒精消毒氣室部位。（2）用無菌鑷子除去膠布并去除氣室部分的卵殼。（3）用無菌的毛細吸管插入尿囊腔中輕輕吸取尿囊液（避開血管裂開），置于無菌試管中。（4）獲得的尿囊液取一部分做血凝和血凝抑制試驗（定性），推斷病毒的增殖狀況并對病毒進行鑒定；同時做無菌試驗。4.3血凝和血凝抑制試驗（1）血凝試驗 血凝試驗的具體操作方法，參照本教材的第四章第四節內容：病毒的分別培育鑒定和血清學檢測。[結果推斷]以“+”號多少表示血凝程度：++++100％的RBC發生血凝，形成花邊拉網狀，紅細胞呈薄層勻整鋪于板孔底，呈細沙狀或薄膜狀；+++75％的RBC發生血凝，紅細胞雖鋪于孔底，呈細沙狀，但邊緣不整有下沉趨勢；++50％的RBC發生血凝，紅細胞在孔底呈一環狀，四周有小凝集塊；+25％的RBC發生血凝，紅細胞在孔底沉聚呈小圓點，邊緣不光滑，四周有小凝集塊；-100％的RBC沉積，紅細胞于孔底呈一小圓點，邊緣光滑整齊，無凝集現象。 以使50％的RBC發生凝集的最高稀釋倍數，為病毒的血凝效價。計算藥物的MIC。（2）病毒血凝抑制試驗 依據血凝試驗滴定的病毒血凝效價，以“2＋”的凝集者含有1個病毒血凝單位。如流感病毒的血凝效價為1:160，即病毒液稀釋至1:160時，每0.25ml中含1個血凝單位，若要將0.25ml病毒液配制成含4個血凝單位時，應稀釋成1:（160÷4），即1:40稀釋。在做血凝抑制試驗時用4個血凝單位。將病毒液配成4個血凝單位。血凝抑制試驗的方法，參照本教材的第四章第四節內容：病毒的分別培育鑒定和血清學檢測。主要依據細胞對病毒的敏感性選擇適宜細胞株。人類病毒用人或猴的組織較敏感，因此，探討人的病毒性疾病常用人胚腎、人胚肺或人羊膜細胞。組織培育的方法中以單層細胞培育是最常用的方法，它又有原代和次代細胞培育、二倍體細胞株和傳代細胞系三種類型。本試驗僅介紹對傳代細胞的操作方法。二）細胞培育法1.病毒TCID50滴定（1）原理多數病毒感染體外培育的細胞后，常引起細胞形態學變更，如細胞團縮、裂解和細胞腫大等，這種變更稱為病毒致病變效應（cytopathiceffect，CPE），可以干脆通過顯微鏡視察，亦可通過染色得以識別和推斷。CPE的程度可間接反映病毒的毒力，因此利用這種特征可以用來測定病毒的毒力。即能在半數細胞培育板孔或試管內引起細胞發生病變所需的病毒量，定義為病毒的50％組織細胞感染指數（50％tissuecultureinfectiousdose，TCID50）。在從事藥物的抗病毒試驗中，常用100TCID50的病毒感染量進行。測定時，首先在微量細胞板上培育敏感細胞，待細胞貼壁形成單層，棄上清。將待測病毒用維持液做連續10倍系列稀釋后加入細胞單層，逐日視察，直至病毒產生的CPE不再進展為止。具體時間依據病毒的增殖特點而定，如腸道病毒增殖快速，一般48h即可；RSV、VSV增殖也較快，因此48~72h也可以視察、染色、計算。（2）試驗材料 細胞：MDCK細胞或Hep-2細胞，或其它敏感細胞。 病毒：流感病毒（IFV）或呼吸道合胞病毒（RSV）。 試劑：DMEM細胞培育基，新生小牛血清，胰蛋白酶或VTP消化液，PBS，青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml，MTT(4,5-二甲基噻唑-2,5-二苯基四唑溴化物)，結晶紫染液等。 材料：細胞培育板（1塊/組），tip頭（2盒/排），微量移液器，5ml或10ml吸管（2支/組），青霉素瓶帶塞（10個/組），酒精缸，鑷子（2個/組），1ml注射器，毛細吸管等。（3）操作步驟1）制備細胞①將細胞生長面朝上，輕輕倒掉瓶中培育液，用PBS當心洗滌2次，留意吸管尖頭不要伸到細胞瓶中。②用上述吸管吸取1mlVTP加入細胞瓶中，鋪滿整個細胞生長面即可；室溫或手握住消化，約3～5min。當細胞胞質回縮、細胞間隙增大呈拉網狀后，即可停止消化，盡可能棄盡消化液，接著利用殘余的消化液消化，直至細胞大部分易在外力作用下從細胞瓶表面脫落下來為止。③加入適量養分液到細胞瓶中，用小頭吸管吹打瓶壁細胞以及脫落細胞充分使細胞勻整，吹打時動作要溫順不要用力過猛，盡可能不要出現泡沫。吸一滴細胞懸液于Ep管中。④計數：用吸管吹打細胞懸液，取少許細胞懸液與等量0.04％臺盼蘭混勻，在計數板上蓋玻片的一側加該細胞懸液，加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡。當細胞密度為106/ml時即可。 一瓶細胞消化后加入適量養分液制成所需細胞懸液，濃度約為1×106/ml。用微量移液器將細胞懸液加入40孔板微孔中，每孔100μl，37℃、5%CO2孵育箱培育24h，形成單層后，做病毒滴定用。2）50%組織細胞感染量（TCID50）測定①稀釋病毒液：取無菌青霉素瓶9支，各管分別加3%小牛血清的維持液2.7ml，然后向第一管加IFV病毒液0.3ml，反復吹吸混合三次，從第一管內吸液0.3ml加入其次管內，反復混合三次，從其次管內吸液0.3ml加入第三管內，反復混合三次，依此類推將待測的病毒液做連續10倍稀釋，使病毒稀釋為10-1，10-2，10-3…10-9。②病毒接種：將長好單層細胞的培育板各孔細胞液全部傾棄，用微量移液器把各稀釋度的IFV病毒從低濃度起先依次加入各微孔中，每稀釋度平行加2孔，每孔100μl。細胞比照孔不加病毒液，只加維持液。置37℃、5%CO2孵育箱中孵育。③結果視察：于孵育后18、24、36、48、72h在倒置顯微鏡下視察CPE，病毒可引起細胞圓縮、堆聚及脫落等現象。“-”表示細胞正常；“+”表示有25%細胞產生病變、圓縮、裂開脫落；“2+”有50%細胞產生病變；“3+”有75%細胞產生病變；“4+”有75%以上細胞產生病變（試驗時，有的視察24h~48h即可染色計算；或逐日視察CPE，直至病毒產生的CPE不再進展為止）。3）按Reed-Muench法計算TCID50，參見下表：10-38/810010/1010010-42/8262/82510-50/80140/14010-60/80220/22010-70/80300/30010-80/80380/380累積數（孔）病變細胞孔病毒稀釋度病變孔數/接種孔數有病變↑無病變↓比例百分比%

按表中可見，10-3稀釋的病變高于50%；10-4稀釋的病變低于50%；50%病變分布于10-3與10-4之間，計算公式如下：

高于50%病變率-（50%）距離比例=-高于50%的病變率-低于50%的病變率×lg稀釋倍數

100-50

=-100-25×lg10=-0.67 lgTCID50=高于50%病變的低稀釋度對數+距離比=-3+(-0.67)=-3.67即1個TCID50=10-3.67，查0.67的反對數為4.68，即病毒做4.68×103倍稀釋時取0.1ml接種細胞，可使50%細胞產生病變。 附錄：如何計算200個TCID50？ 4.68×103÷200=23.4，將病毒作23.4倍稀釋時即得200個TCID50。按計算結果，用100個TCID50病毒進行藥物的體外抗病毒試驗。2.病毒增殖及病毒感染單位量測定2.1病毒增殖 將凍存的病毒株復蘇后接種于敏感細胞進行增殖，2~3d后出現典型細胞病變，待病變達80~90％時收獲病毒。反復凍融3次并低速離心取上清，分裝后用空斑形成單位試驗（plaqueformingunit,PFU）測定病毒的感染量，保存于-80℃備用。在進行藥物的抗病毒試驗中，亦可用該試驗測定藥物對病毒增殖的影響，而且結果可能更精確、牢靠。2.2病毒感染單位量測定 用PFU表示。以5.0×105/ml的密度接種敏感細胞于6孔細胞板中。置37℃、5％CO2細胞培育箱中培育，使其24h內長成單層；在冰盤上操作，用維持液將病毒作10倍連續系列稀釋（10-1～10-8）（操作如下圖所示）；注：即在一系列2ml的Ep管中先加入1.8ml維持液，取

0.2ml

病毒加入第一只Ep管中，充分混勻后病毒稀釋度為10-1，取混合后的0.2ml

病毒懸液加入其次只Ep管中作為稀釋度10-2，依此類推作系列稀釋，則得到連續10倍稀釋的病毒懸液。棄去細胞培育板中各孔中的養分液，每孔接種相應稀釋度的病毒懸液0.5ml，每個稀釋度重復3孔。37℃吸附2h，每15min搖動數下以保證病毒吸附分布勻整；棄去各孔中的病毒液，PBS輕輕洗滌一次。每孔加入2ml覆蓋層（含6％新生牛血清的DMEM與1.5％瓊脂糖等體積混勻，配好后馬上運用，以免凝固），水平放置15min使其凝固；33℃，5％CO2細胞培育箱中培育3d。剔除覆蓋層，每孔加入1ml0.5％結晶紫染色10min，自來水沖洗后選擇空斑數清晰且易于辨別的稀釋度計數空斑，依據空斑數計算病毒的PFU。下圖顯示的是RSV的空斑形成試驗結果。PFU的計算方法：a·bPFU＝v（PFU：空斑形成形成單位/ml；a：空斑均數；b：病毒稀釋度的倒數；v：病毒量/ml）

1：正常比照；2～6：病毒稀釋度分別為

10－4，10－5，10－6，10－7，10－8

病毒的空斑形成試驗結果示意圖

3

2

16542.藥物對細胞的毒性測定 已長成單層的細胞（96孔板），傾去培育液，用PBS洗滌2次，加入用無血清1640作連續10倍系列稀釋的受試藥物，100μl/孔，每個濃度重復4孔，并設正常細胞比照。整個試驗重復3次。37℃、5%CO2孵箱中培育3d，視察細胞病變效應（CPE），按Reed-Muench法計算藥物的半數中毒濃度（TD50）和最大無毒濃度（TD0）。陽性比照藥的毒性測定，與受試藥物同法同步在同一板中進行。4.藥物的抗病毒試驗4.1微量細胞病變抑制法 已長成單層的細胞（96孔板），傾去培育液，用PBS洗2次，加入100TCID50病毒，100μl/孔，37℃5%CO2下吸附2h，使病毒進入細胞內。棄病毒液，用DMEM液洗2次，洗去游離病毒。加入受試藥的TD0濃度作連續2倍系列稀釋的6個濃度，每個濃度均重復3孔，并分別設立細胞比照、病毒比照和空白比照孔，陽性比照藥同上。37℃、5%CO2下培育3d，記錄CPE，按Reed-Muench法計算能抑制50%CPE產生的藥物有效濃度（EC50）。整個試驗重復3次。4.2中性紅染色法 基本步驟同上，加入藥物培育3d后待CPE不再進展時，棄維持液，用PBS洗2次，每孔加入0.2ml中性紅染液（0.04%），避光，37℃、5%CO2孵育1.5h。棄染色液，用PBS洗2次，控干，每孔加入0.2ml的90%乙醇（無水乙醇：0.2M，pH4.2枸櫞酸緩沖液=9：1），室溫放置2~3h，搖勻，以空白比照孔調零，在酶標儀546nm處比色，測定其吸光度A值。依據各組的平均A值，計算藥物的抑制百分率，再按Reed-Muench法計算50%抑制濃度（IC50）等各項結果。整個試驗重復3次。 試驗組平均A值-病毒比照組平均A值抑制百分率=細胞比照組平均A值-病毒比照組平均A值×100%4.3MTT法 基本步驟同上，當病毒比照組細胞CPE在(+++)～(++++)時棄培育液上清，每孔加入含5g·LMTT的培育液50μl，接著培育2~3h后棄去MTT上清，每孔加DMSO100μl，混勻5min后，用酶標儀測570nm波特長的吸光度A值。按下述公式計算藥物對病毒的抑制率：病毒抑制率(%)=(藥物處理組A均值-病毒比照組A均值)/(細胞比照組A均值-病毒比照組A均值)×100%，結合細胞毒性試驗的結果，用統計軟件SPSS13.0的Probit回來法，或按Reed-Muench法，計算受試藥的半數中毒濃度TD50和半數有效濃度EC50，并計算藥物的治療指數（TI）。4.4空斑抑制法 參照上述方法進行（略），與病毒比照組比較，計算藥物的50%抑制濃度IC50。4.4藥物對RSV侵入細胞的阻斷作用 依據藥物毒性試驗的結果，從藥物的最大無毒濃度起先，將不同濃度受試藥100μl預先處理細胞2h,以PBS洗滌2次后用100TCID50的病毒每孔100μl攻擊,吸附2h，每隔15min搖擺1次，使病毒勻整吸附。棄病毒液,加100μl細胞維持液，置37℃、5%CO2培育，每日視察并記錄CPE。試驗設正常細胞比照組、病毒比照組、陽性比照組和藥物組。當病毒比照組CPE在75%~100%時棄培育液上清，每孔加入含5g·LMTT的培育液50μl，接著培育2～3h后棄去MTT上清，每孔加100μlDMSO，混勻5min后，用酶標儀測490nm波特長的A值。按Reed-Muench法計算藥物的半數中毒濃度TD50和半數有效濃度EC50。4.5藥物對RSV的干脆殺傷作用 依據藥物毒性試驗的結果，從藥物的最大無毒濃度起先，將不同濃度的含藥維持液與100μl的100TCID50病毒等體積混合，37℃、5%CO2條件下作用2h后，再將其感染Hep-2細胞，100μl/孔，吸附2h后用PBS洗滌2次，每日視察并記錄細胞病變效應（CPE）。試驗設正常細胞比照組、病毒比照組、陽性比照組和藥物組。當病毒比照組細胞CPE在75%~100%時棄培育液上清，每孔加入含5g·LMTT的培育液50μl，接著培育2~3h后棄去MTT上清，每孔加DMSO100μl，混勻5min后，用酶標儀測490nm波特長的A值。按Reed-Muench法計算藥物的半數中毒濃度TD50和半數有效濃度EC50。5.治療指數（TI） 按TI=TD50/EC50或TD50/IC50進行計算。藥理學試驗規定，TI﹥4表示藥物有效。三）體內抗病毒試驗1.試驗動物的選擇 試驗動物在病毒學探討中的用途主要有：分別與鑒定病毒、制備疫苗及診斷抗原、制備免疫血清、探討病毒的致病性、免疫性、發病機理及有效藥物療法等。病毒接種于何種動物以及選擇何種接種途徑，主要取決于病毒的種類和試驗探討的目的。應依據試驗須要選擇最敏感動物作為試驗對象，常用的動物有小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、乳鼠和猴子等，接種時要依據病毒對動物及組織細胞的親嗜性而選擇特定的部位，常用接種途徑有鼻腔、腹腔、腦內、皮下、肌肉、靜脈及小鼠經口接種、家兔角膜注射等。給藥方式亦可有腹腔、灌胃、靜脈注射、肌肉注射、吸入等。采集全血、血漿、血清、組織臟器或細胞等標本，進行相應指標的檢測。為削減個體差異，一般試驗選擇成年動物，動物體重盡可能一樣；如無特殊要求，試驗動物的性別應先選雄性動物或雌雄各半，且動物要健康，雌性動物懷孕及授哺期不宜接受。此外，依據試驗探討不同的精確程度要求，選擇標準化試驗動物。標準化試驗動物是指按遺傳限制方法和微生物限制標準培育而成的動物。按遺傳學限制原理可分為近交系、遠交系、突變系、雜交一代等，按微生物學限制原理可分為無菌動物、悉生動物、無特定病原體動物、清潔動物等。病毒接種完成后，按確定級別的動物飼養標準飼養，比照組與試驗組分籠飼養。2.病毒接種方法2.1鼻腔接種法 試驗組小鼠先用乙醚淺麻后，將小鼠頭部仰起，向鼻腔內緩慢滴入確定感染量的病毒懸液100μl左右，正常比照組鼻腔滴入等量不含病毒的PBS或生理鹽水，要駕馭麻醉的深淺度。麻醉太深，小鼠能將病毒懸液干脆吸入肺中，引起肺水腫，往往于接種后1d內死亡；麻醉太淺，小鼠又試圖將接種物咳出。2.2小白鼠腹腔接種（1）用無菌注射器以無菌操作法吸取病毒懸液，解除氣泡（將注射器針頭朝上，使氣泡上升，在針頭上裹以消毒棉球，然