實驗基本技術第一頁，共八十頁，2022年，8月28日細胞培養基本技術第二頁，共八十頁，2022年，8月28日無菌操作技術消毒(disinfection)和消毒劑(disinfectant)滅菌(sterilization)防腐(antisepsis)和防腐劑抑菌(bacteriostasis)和抑菌劑(bacteriostatic)無菌(asepsis)無菌技術/無菌操作(antiseptictechnique)第三頁，共八十頁，2022年，8月28日【培養前準備】在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關數據的計算要事先做好。根據實驗要求，準備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養室、超凈臺)內，然后開始消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。

【操作野消毒】無菌培養室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養細胞和培養用液同時照射紫外線，消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果?！┎僮饔镁呷缫埔浩?、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內同時紫外線消毒。

第四頁，共八十頁，2022年，8月28日【洗手和著裝】原則上和外科手術相同。平時僅做觀察不做培養操作時，可穿著細胞培養室內紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內，應著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養室都要重新用消毒液洗手。進入原代培養室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽?！净鹧嫦尽吭跓o菌環境進行培養或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經過燒灼進行。【操作】進行培養時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。第五頁，共八十頁，2022年，8月28日培養細胞的觀察１．肉眼觀察培養物顏色及混濁度２．倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態第六頁，共八十頁，2022年，8月28日第七頁，共八十頁，2022年，8月28日細胞計數1、將血球計數板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數板上。

2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計算計數板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算：

細胞數/ml＝4大格細胞總數/4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。

第八頁，共八十頁，2022年，8月28日第九頁，共八十頁，2022年，8月28日根據細胞生長的恃點，傳代方法有3種：1．懸浮生長細胞傳代離心法傳代：離心（1000轉/分）去上清，沉淀物加新培養液后再混勻傳代。直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。2．半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞）此類細胞部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。3．貼壁生長細胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。細胞傳代方法第十頁，共八十頁，2022年，8月28日貼壁生長細胞傳代方法1吸光培養瓶中的培養液2加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準）靜置2-10min（顯微鏡下動態監測）。3吸去胰蛋白酶液，加入培養液。4用吸管吸取瓶內培養液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。5離心，細胞沉淀用培養液制成懸液。5吸取1/10—1/40細胞懸液，接種于新的培養瓶內。6加適量新鮮培養液于接種了細胞懸液的新培養瓶內。7將后者放入培養箱中培養。第十一頁，共八十頁，2022年，8月28日任何培養瓶內生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態上區別死、活細胞是困難的。在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。培養細胞活力測定第十二頁，共八十頁，2022年，8月28日1．臺盼藍法活細胞不被染色，死細胞染成藍色；用活細胞占細胞中的百分比表示細胞活力；方法：

1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中；

2、加入0.5ml0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘；

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片；

4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數，計細胞活力；

死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

活力測定可以和細胞計數合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。

第十三頁，共八十頁，2022年，8月28日2．四唑鹽（MTT）比色法

四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍；MTT比色法的原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值；MTT法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。第十四頁，共八十頁，2022年，8月28日操作步驟：

（1）單細胞懸液接種于96孔培養板；103-104細胞/孔，每孔培養基總量200微升（96孔培養板每孔容積370微升），37℃、5％CO2培養箱中培養一段時間（根據實驗目的決定培養時間）；（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；繼續培養3小時；（3）吸出孔內培養液后，加入DMSO液（150微升／孔），將培養板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結晶物溶解；（4）酶標儀檢測各孔OD值（檢測波長570納米）。記錄結果，繪制細胞生長曲線。第十五頁，共八十頁，2022年，8月28日第十六頁，共八十頁，2022年，8月28日細胞凍存和復蘇細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少入力、經費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。第十七頁，共八十頁，2022年，8月28日凍存和復蘇的原則：慢凍快融

當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反，結晶很大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。第十八頁，共八十頁，2022年，8月28日慢凍程序標準程序：

當溫度在-25℃以上時，1～2℃/min當溫度達-25℃以下時，5～10℃/min當溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內降至液氮表面，停30分鐘后，直接投入液氮中。第十九頁，共八十頁，2022年，8月28日低溫保護劑的應用在細胞凍存時加入低溫保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。第二十頁，共八十頁，2022年，8月28日細胞凍存方法1．預先配制凍存液：含20%血清培養基，10%DMSO，DMSO液用培養液配好，避免因臨時配制產熱而傷害細胞；2．取對數生長期細胞，經胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細胞懸液（1×106～5×106細胞/ml)；3．加入1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。第二十一頁，共八十頁，2022年，8月28日細胞復蘇方法

（1）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）；（2）5分鐘內用培養液稀釋至原體積的10倍以上；（3）低速離心10分鐘；（4）去上清，加新鮮培養液培養剛復蘇的細胞。第二十二頁，共八十頁，2022年，8月28日免疫組化基本技術第二十三頁，共八十頁，2022年，8月28日

1、標本的取材

2、組織的固定

3、脫水、透明和包埋

4、切片 一、組織與細胞材料的制備第二十四頁，共八十頁，2022年，8月28日手術切除標本，各種活檢穿刺標本、尸體解剖標本和動物組織標本。原則上，應盡快取材，但比較大的手術標本如胃、肺、腸等器官，最好先固定后取材。細胞大量培養后，經消化將細胞制成懸液（106）涂在涂有切片粘合劑的載玻片上，涼干后固定。1、標本的取材第二十五頁，共八十頁，2022年，8月28日防止組織細胞的死后變化，防止自溶和腐敗，以保持組織細胞的固有形態。使細胞內的蛋白質、脂肪、糖和酶等各種抗原成份轉變成不溶性物質，以保持它原有的結構與生活時相仿。

常用固定液有：甲醛、4％多聚甲醛、BouinS液等。固定時間要視組織塊的厚薄，固定液的種類及濃度，溫度而定，原則上，組織塊大小與固定時間成正比，固定液的穿透力及濃度與固定時間成反比。組織固定后必須徹底沖洗。2、組織標本的固定第二十六頁，共八十頁，2022年，8月28日脫水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ乙醇，無水乙醇

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ

浸蠟：石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ、石蠟Ⅲ

石蠟包埋：修蠟塊，標號

3、組織脫水、浸蠟及包埋

第二十七頁，共八十頁，2022年，8月28日切片可分石蠟切片、冰凍切片、火棉膠切片，IHC切片要求不同與常規切片，需連續有序，防止脫片等特殊要求。4、組織切片第二十八頁，共八十頁，2022年，8月28日

1、石蠟切片的脫蠟至水

2、內源性酶的消除方法

3、熱誘導的抗原修復

4、顯示系統的選擇和配制

5、襯染劑的選擇和配制

二、IHC的一些基本技術第二十九頁，共八十頁，2022年，8月28日冰凍切片從-80℃取出，涼干或電吹風吹干后可直接進行免疫組化標記。石蠟切片需經如下脫蠟才能做IHC。

二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，二甲苯10minⅢ，無水乙醇2min，95％乙醇2min，85％乙醇2min，75％乙醇2min，流水沖洗。

1、石蠟切片脫蠟至水第三十頁，共八十頁，2022年，8月28日1.內源性過氧化物酶的消除方法：0.3%～3%H2O2甲醇液20min；1％H2O220min；3％苯肼溶液37℃1h；0.075%鹽酸甲醇液30min等。

2.內源性堿性磷酸酶的消除方法：10％醋酸10min；0.5mol/L碳酸氫鈉（pH9.0）20min；1mol/L左旋咪唑20min。

3.內源性生物素的消除方法：2-甲基-D苷露糖飽和生物素；先用25μg/ml卵白素孵育15min，PBS洗10min，移至生物素飽和液中處理15min，PBS洗15min。2、內源性酶的消除方法第三十一頁，共八十頁，2022年，8月28日1.抗原修復(AntigenRetrieval;AR)是以高溫、高壓對常規固定的石蠟切片進行抗原修復或復原的一種非蛋白酶消化以提高抗原抗體陽性檢測的一種方法和技術手段。

2.修復方式：①微波96℃±10min×2；②直接加溫100℃，15min；③水浴鍋100℃，15min；④高壓鍋/消毒鍋120℃，5min；⑤真空加熱10min；⑥直接烤片法。3、熱誘導的抗原修復第三十二頁，共八十頁，2022年，8月28日

3.修復介質：①0.01MpH6.0檸檬酸緩沖液(CB)；②0.05mTris-HCL(pH1-12系列);③0.01MpH7.0PBS;④2%硫酸鋁；⑤2％硝酸鋁；⑥生理鹽水；⑦蒸餾水。認為修復介質種類和溶液的摩爾濃度對修復效果影響較小，而pH值則影響較大。緩沖液以CB和Tris-HCL較常見。

4.溫度與修復時間的關系：許多的實驗結果表明，溫度高修復時間短，呈正相關。例如，Ki-67、P-gp的檢測，利用同一切片，達到相同的染色結果如下步驟：①100℃20min；②90℃40min；③80℃60min；④70℃20h。3、熱誘導的抗原修復第三十三頁，共八十頁，2022年，8月28日

目前用于IHC的標記酶主要有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AKP）。HRP顯示系統為：3、3’-二氨基聯苯胺鹽酸鹽(3、3’-diaminbezidine;DAB)、3-氨基-9-乙基卡吧唑(3-amino-9-ethlylcarbazde;AEC)、四甲基聯苯胺、鹽酸對苯二胺、4-氯-1-萘酚、高香草酸、α–萘酚派若寧HRP顯示系統為：BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸)＋NBT(硝基四氮唑藍)、α–萘酚AS-BI磷酸鹽＋快紅或快藍。4、顯示系統的選擇第三十四頁，共八十頁，2022年，8月28日5、襯染劑的選擇和配制1.Mayer氏蘇木素：取1gMayer氏蘇木素加溫溶于100ml蒸餾水中，再加入50g碘酸鈉和50g鉀明礬，溶解后加入枸櫞酸和水合氯醛，溶解后過濾。

2.Harris氏蘇木素：取2.5gHarris氏蘇木素溶于25ml無水乙醇中，另將鉀明礬加溫溶于500ml蒸餾水中，待鉀明礬全部溶解，再將二液混合在一起，加入氧化汞，溶解30min，冷卻后過濾，使用時加醋酸4ml，可增加染色強度。第三十五頁，共八十頁，2022年，8月28日3.甲基綠：取2％甲基綠水溶液20ml傾入潔凈的分液漏斗，加入三氯甲烷充分搖蕩混合，使甲基綠中的甲基紫溶于氯仿中而呈紫紅色。旋動分液漏斗下部的砂塞，移去紫紅色的三氯甲烷，如此反復更換氯仿，直到氯仿為無色。

4.核固紅：取0.1g核固紅溶于100ml15％硫酸鋁水溶液，加熱溶解，冷卻后過濾。5、襯染劑的選擇和配制第三十六頁，共八十頁，2022年，8月28日第三十七頁，共八十頁，2022年，8月28日第三十八頁，共八十頁，2022年，8月28日第三十九頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十一頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十二頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十三頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十四頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十五頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十六頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十七頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十八頁，共八十頁，2022年，8月28日第四十九頁，共八十頁，2022年，8月28日第五十頁，共八十頁，2022年，8月28日第五十一頁，共八十頁，2022年，8月28日RT-PCR基本技術第五十二頁，共八十頁，2022年，8月28日Trizol提取RNA原理Trizol法提取細胞總RNA是目前常用的提取方法。細胞內大部分的RNA與蛋白質結合在一起，以核蛋白形式存在。Trizol內含異硫氰酸胍和苯酚等物質。異硫氫酸胍(GuSCN)是一種強的蛋白質變性劑，不僅能使細胞裂解，同時還能有效地抑制細胞內源性RNA酶的活性。通過有機溶劑的分步抽提，最終可獲得純度較高的細胞總RNA。第五十三頁，共八十頁，2022年，8月28日RNA提取注意事項

Trizol試劑含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。如皮膚接觸Trizol，請立即用大量水沖洗。RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注意隨時勤換手套，樣品盡可能蓋嚴；盡量不要對著RNA樣品呼氣或說話。用0.01%的DEPC水浸泡過夜，然后滅菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。細胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會降低最后得率，因為一部分RNA會殘留在未裂解的細胞中。在清洗和裂解細胞時最好在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內源RNase降解了RNA。

第五十四頁，共八十頁，2022年，8月28日逆轉錄(ReverseTranscription)逆轉錄指遺傳信息從RNA流向DNA，是RNA指導下的DNA合成過程，即以RNA為模板，四種dNTP為原料，合成與RNA互補的DNA單鏈，稱為互補DNA(complementaryDNA, cDNA)RNADNA逆轉錄酶第五十五頁，共八十頁，2022年，8月28日逆轉錄原理cDNA合成有兩個關鍵因素，一是病毒RNA的質量，二是逆轉錄酶。逆轉錄酶是一種多功能酶，它能在一定的條件下，以單鏈RNA為模板合成第一條cDNA鏈。通過RNaseH活性水解RNA-DNA雜合分子中的RNA鏈。第五十六頁，共八十頁，2022年，8月28日逆轉錄酶催化逆轉錄過程的酶稱逆轉錄酶，RNA病毒中都含有此酶。具有三種酶活性：RNA指導的DNA聚合酶

RNA水解酶活性

DNA指導的DNA聚合酶第五十七頁，共八十頁，2022年，8月28日逆轉錄體系RNA模板——

3’UUAGGCCUGGAUAAGCGCCUGGA5’引物——

5’ATCCGGAC逆轉錄酶dATPdGTPdCTPdTTPMn2+酶活性依賴金屬離子底物第五十八頁，共八十頁，2022年，8月28日逆轉錄過程中cDNA的合成依賴RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依賴DNA的DNA聚合酶第五十九頁，共八十頁，2022年，8月28日逆轉錄引物的選擇Oligo(dT)(12-18個核苷酸組成），只有mRNA被逆轉錄隨機六聚寡核苷酸，所有RNA均被逆轉錄基因特異性引物，僅產生需要的DNA第六十頁，共八十頁，2022年，8月28日以DNA為模板，利用DNA聚合酶的特性體外擴增特定的基因片斷，這種方法被稱為DNA聚合酶鏈式反應。PCR

基因放大連瑣反應PCR反應第六十一頁，共八十頁，2022年，8月28日PCR基本原理利用高溫可使DNA變性和低溫可使DNA復性的特性，根據體內細胞分裂中DNA半保留復制機理，以特異性寡核苷酸為引物，DNA分子為模板，在DNA聚合酶和四種脫氧核苷酸存在的條件下體外合成新DNA分子的過程。這種熱變性-復性-延伸的過程就是一個PCR循環，PCR就是在合適條件下的這種循環的不斷重復。第六十二頁，共八十頁，2022年，8月28日第六十三頁，共八十頁，2022年，8月28日PCR基本成分templateprimersTaqpolymerase10×PCRbufferdNTPsMg++第六十四頁，共八十頁，2022年，8月28日PCRPrimers第六十五頁，共八十頁，2022年，8月28日PCRPrimers序列發現的時間和發現者序列的生物體來源序列的組織來源第六十六頁，共八十頁，2022年，8月28日第六十七頁，共八十頁，2022年，8月28日引物設計引物長度（length）:20～30bp引物中四種堿基的分布應該是隨機的兩引物間不能有互補序列，尤其是3‘端引物的堿基順序不應與非擴增區域由同源性引物的3’末端堿基一定要與模板DNA配對可以在5’末端加上限制性內切酶位點或起始密碼解鏈溫度(Tm)：兩引物間相差不大于5℃引物內部不能有大于3bp的反向重復序列或自身互補序列存在第六十八頁，共八十頁，2022年，8月28日PCR基本程序預變性（Pre-denaturation)變性(Denaturation)退火(Annealing)延伸(Elongation)25-30cycles第六十九頁，共八十頁，2022年，8月28日PCR反應取無菌02mlPCR管一支，加入：10PCR緩沖液5μl氯化鎂4μl4種ｄNTP混合液(10mmol/L)05μl3端引物(10μmol/L)1μl5端引物(10μmol/L)1μlTaqDNA多聚酶(5u/μl)025μl三蒸水3325μl模板cDNA5μl蓋緊蓋子，離心數秒后置PCR儀上進行擴增。PCR循環為：95℃預變性2min，95℃變性30s、55℃復性30s、72℃延伸1min，30個循環，最后72C延伸7min。第七十頁，共