歡迎閱讀本文檔，希望本文檔能對您有所幫助!歡迎閱讀本文檔，希望本文檔能對您有所幫助!感謝閱讀本文檔，希望本文檔能對您有所幫助!感謝閱讀本文檔，希望本文檔能對您有所幫助!歡迎閱讀本文檔，希望本文檔能對您有所幫助!感謝閱讀本文檔，希望本文檔能對您有所幫助!項目名稱：動脈粥樣硬化發病機制及其診治與干預的基礎研究首席科學家：劉德培中國醫學科學院基礎醫學研究所起止年限：2011.1至2015.8依托部門：衛生部

二、預期目標總體目標：本項目旨在從我國AS人群特有的遺傳背景及分析致病的內外環境危險因素為切入點，結合系統生物醫學觀念和手段,針對在AS發生中起重要作用的內外環境中有利和不利因素，闡述AS發生、發展和轉歸的規律,揭示血管重塑和AS斑塊不穩定的機理,結合臨床研究為制定適合我國國情的針對AS及其并發癥的早期預警和早期干預策略及防治方案提供新的思路和科學依據，積極推進臨床轉化。五年預期目標：闡明能量限制和特殊飲食，脂質代謝紊亂和含硫氨基酸家族等因素影響AS發病的細胞分子機制；初步闡明血管重塑和動脈粥樣硬化斑塊不穩定的影響因素及分子機制。尋找出1-2個可用于AS新的早期預警分子，并建立其檢測方法和預警指標確定3－5種新的抗AS靶點分子，明確其功能及臨床意義。培養博士生80名，碩士生60名。培養優秀中青年人才，產生杰出青年與長江學者,建設一支優秀的轉化醫學研究人才梯隊。申請一批發明專利，促進開發有自主知識產權的成果轉化。本項目實施中取得的基礎性研究成果將在國際刊物上發表影響因子（IF）>5.0有代表性學術論文60篇，其中IF>10的論文15篇，頂級雜志論文2-5篇。

三、研究方案本課題項目分為六個部分，第一部分開展中國人群AS疾病分子遺傳基礎;第二部分緊密聯系內外環境因素中限制能量飲食和特殊飲食，研究有利和不利因素和機體相互作用在AS發病中的機制;第三部分闡明脂代謝紊亂，尤其是TG和HDL代謝紊亂導致AS的分子機制;第四部分闡述含硫氨基酸家族特別是Hcy與H2S在AS發生和發展中炎癥和免疫作用及其分子機制；第五部分針對血管重塑是AS管腔狹窄的關鍵因素，研究影響血管重塑的因素和作用的分子機制；第六部分針對AS斑塊不穩定及早期防治，研究斑塊從不穩定向穩定的方向轉變的分子機制和干預策略。這六個部分結合系統生物醫學觀念和手段，從臨床提出科學問題，圍繞著AS的發生發展和轉歸的分子調控機制和早期干預這個科學核心進行研究，尋找AS早期預警分子，并建立其檢測方法和預警指標,確定抗AS新靶點分子,探討防治AS的有效方法和降低心腦血管疾病發病率和死亡率的途徑。動脈粥樣硬化發病機制及其診治與干預的基礎研究動脈粥樣硬化發病機制及其診治與干預的基礎研究第一部分中國人動脈粥樣硬化遺傳分子基礎學術思路與技術途徑：1.結合中國人群心肌梗死GWAS和國外人群的研究結果，同時選擇炎癥、脂代謝以及血壓調控通路相關基因，在10000例急性冠脈綜合征病例對照樣本中篩查AS新的基因和遺傳變異。2.采用臨床技術手段測定頸動脈內膜中膜厚度、脈搏波速度等AS亞臨床表型和多種生物標記物，綜合評價遺傳因素與AS發生/發展、以及斑塊穩定性的關系。3.探討重要多態對易感基因轉錄活性的調控作用，尋找與多態可能結合的轉錄因子，進而研究多態對易感基因所在信號通路的調控作用及細胞生理活性改變。應用microRNA技術，確定斑塊發生發展過程中炎癥反應系統表達譜，研究炎癥在冠狀AS斑塊發生發展過程中的作用及機制；并利用動物模型尋找冠狀AS疾病新的遺傳易感基因。4.對2000例社區高危人群進行前瞻性隨訪，動態監測AS相關生理指標的變化和AS的進展情況。評價遺傳位點及其聯合作用與AS指標間的關系，計算人群歸因危險度，構建遺傳因素及環境危險因素的預測模型。亞臨床指標：頸動脈IMT、PWV等亞臨床指標：頸動脈IMT、PWV等SNPs、CNVs及單體型血脂代謝、炎癥反應、血壓相關通路基因AS斑塊鈣化及穩定性評價確定遺傳變異位點中國人群GWAS研究數據的深入挖掘人體測量、血脂、生物標記物檢測2000例社區高危人群10000病例對照人群驗證歐美人群GWAS報道的AS相關位點高危人群隨訪，構建預測模型功能研究揭示遺傳分子機制研究特色與創新：結合中國人群GWAS研究中200萬個遺傳變異信息以及多個代謝通路基因網絡，基于通路和遺傳網絡系統分析SNPs、CNVs和單體型變異信息，采用CART、MARS、MDR、貝葉斯網絡、隨機森林等數學模型，構建遺傳因素及環境危險因素的預測模型，找到檢查、定量臨床疾病亞型的干預靶點，監測疾病進展，確定高危患者，最終實現定量風險評估和個性化早期預警。可行性分析：目前收集了高質量的20000例冠狀動脈綜合征、冠心病和心肌梗死的病例對照資料，為開展大規模重復驗證奠定了基礎。完成了30余個基因與冠心病和腦卒中的關聯和功能研究，發現了數個在國人冠心病和腦卒中發病中具有重要作用的SNPs及單體型。已經應用Affymetrix500K芯片完成了1500例心梗病例對照的全基因組關聯研究，在此基礎上進行了imputation，獲得200萬個遺傳變異信息，并發現一系列顯著關聯位點和區域。應用CART和MARS模型開展了相關代謝通路中11個候選基因的33個SNPs的多基因統計分析，發現SNPs位點間的交互作用在高血壓發生中具有重要作用（Hypertension2006，47：1147-54）。在易感基因功能研究方面，具備分子生物學、真核基因表達調控的研究梯隊，并已開始進行心血管疾病易感基因/多態的功能研究。第二部分內外環境因素影響動脈粥樣硬化發生發展的分子機制學術思路與技術途徑：1.首先構建AS的誘導模型，引進ApoE-/-鼠或LDLR-/-鼠并給與高脂飲食飼養誘導AS模型。給與辣椒素及黃酮類物質喂食，分離動脈，油紅O染色觀察斑塊面積大小。觀察對于斑塊形成和面積大小是否有影響。轉錄組學發現辣椒素和黃酮類物質影響AS發生發展過程相關的信號途徑和分子。對于能量限制，由于小鼠體內致AS必需要高脂飲食，無法直接觀察能量限制對于AS的影響，因此我們在體內和細胞水平進行能量限制，通過轉錄組學發現能量限制影響到的基因，對該基因進行深入研究。2.對找到的分子，進行體內和體外實驗闡明其功能。在細胞水平，我們通過過表達，干擾以及分子的激活劑和抑制劑處理觀察對于不同細胞功能的影響，如對內皮細胞的衰老，對平滑肌細胞的增殖和遷移，對巨噬細胞的吞噬功能的影響；在動物水平，我們構建轉基因和基因敲除動物，并與ApoE-/-鼠雜交，同時給予高脂飲食，最后觀察對于斑塊的形成及面積大小有無影響。3.對于這些分子的起作用的機制，我們利用蛋白質相互作用的技術方法找到這些分子的相互作用蛋白，闡明信號通路；并通過基因表達調控的方法和技術，闡明對于下游基因表達和調控的影響。通過明確信號通路和下游基因構建小范圍的相互作用圖譜。4．對于研究中發現起作用的關鍵分子，探討其作為診防治靶點的可能性。獲取臨床標本，觀察AS發病與關鍵分子的RNA、蛋白表達水平是否存在相關性；分析關鍵分子的激活劑或抑制劑是否抑制或促進AS的發生發展。明確該分子是否可作為AS診防治的靶點。血管功能與AS斑塊血管功能與AS斑塊分析轉基因/基因敲除等動物實驗過表達或干擾等分子生物學技術信號通路與細胞功能變化提供診、防、治靶點與措施基因表達譜改變，蛋白質組學變化AS關鍵調控分子構建分子作用小網絡組蛋白修飾，DNA甲基化等表觀遺傳學變化能量限制及辣椒素，黃酮等類物質的特殊飲食研究特色與創新：1.本研究從能量限制這個新視角探討AS的發病機制，具有很強的原創性和新穎性。2.提出辣椒素等特殊飲食對于AS發病的影響。將外源性環境因素與其內源性作用靶點聯系起來，探討動脈粥樣發病的分子機制。可行性分析：課題組長期從事AS的研究，對于內外環境因素影響AS的發病及其機制的研究具有較好的實驗基礎。前期已系統研究了一些特殊飲食的作用及靶點和能量限制的相關分子，建立了各種血管細胞的原代培養模型和多種檢測細胞功能的方法；擁有成熟的分析基因表達調控和信號傳導以及表觀遺傳調控的分子生物學方法。有轉基因動物構建技術和平臺，并有辣椒素靶點TRPV1敲除鼠及能量限制相關分子Sirtuins基因家族的轉基因動物、組織特異性轉基因動物和基因敲除動物。第三部分脂代謝紊亂導致動脈粥樣硬化發病的分子機制學術思路與技術途徑：體外研究：1.原代培養血管內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞，與不同類型富含TG脂蛋白以及II型糖尿病患者HDL共培養，用氧化應激和炎癥通路相關因子矩陣PCR和蛋白組學方法，確認特異性的氧化應激途徑；明確促進內皮環氧合酶2（COX2）活性和表達的分子機制；2.應用RNA干擾、特異性抗體和特異性激動和阻斷劑，對脂質沉積、細胞活化、增殖和凋亡等AS病變以及COX2表達等細胞生物學終點進行干預分析；3.免疫共沉淀法確認與清道夫受體A（SR-A）胞漿域特異結合的分子，并通過篩選噬菌體肽庫釣取與胞漿區特異性結合的多肽，進一步對這些分子和多肽進行抗AS功能分析。體內研究：1.制備AS易感的高TG小鼠模型，喂飼高脂食物以及損傷其動脈壁加速AS形成，檢測動脈、心臟和肝臟的基因組、蛋白組和代謝組學的改變，并分析這些組織的氧化應激、炎癥以及脂代謝通路中相應的改變，并用其他動物模型進一步驗證。2.在此基礎上選擇數個干預靶點進行實驗性治療。同時尋找對高TG所致AS有預測性的生物標識物，并在相應的臨床病人中進行驗證。3.制備干擾SR-A胞漿結合域功能的轉基因小鼠模型，以驗證在體內是否能夠減緩AS的形成。并應用從多肽庫篩選得到的干擾SR-A胞漿結合域的多肽進行實驗性治療，為臨床防治AS提供新的措施。血管壁、心臟和肝臟的基因組、蛋白組及代謝組學分析氧化應激和炎癥通路矩陣PCR和蛋白組學確認靶分子；結合分子對體外實驗確認的靶點實驗性治療RNAi、抗體、抑制劑拮抗驗證激活、增值、脂質沉積、COX2表達；SR-A血管壁、心臟和肝臟的基因組、蛋白組及代謝組學分析氧化應激和炎癥通路矩陣PCR和蛋白組學確認靶分子；結合分子對體外實驗確認的靶點實驗性治療RNAi、抗體、抑制劑拮抗驗證激活、增值、脂質沉積、COX2表達；SR-A胞漿域結合分子原代血管內皮、平滑肌、巨噬細胞，表達SR-A的293細胞高脂食物誘導和動脈壁球囊損傷（體內研究方案富含TG脂蛋白、II型糖尿病患者HDLAS易感的ApoCIII轉基因和LPL缺陷高TG動物模型不同類型的AS病變形成，心、肝其它器官的血管病變體外研究方案對比分析闡明高TG導致AS的新通路闡明高TG導致AS的新通路確定新的抗AS靶點提出早期干預AS的新措施研究創新性：高甘油三酯血癥可通過氧化應激導致AS形成；證明清道夫受體A的胞漿域在AS發生中起關鍵作用；發現HDL具有調節內皮細胞環氧化酶1的新功能。應用系統生物學手段對這些新發現進行從分子、細胞到整體水平進行深入探索，從而提出新的假說和理論。可行性分析：圍繞本課題的設置，已經建立了多項實驗技術，并取得了較多相關的預實驗結果，包括：1)發現了富含TG脂蛋白攜帶大量的脂質過氧化產物，并通過氧化應激反應引起內皮細胞的活化，有可能成為AS形成的始動因素；2)通過對巨噬細胞中的清道夫受體SRA1胞漿域的相互作用研究，發現了具有結合胞漿域功能并干擾氧化LDL內吞作用的基因GRP78。據此合成的多肽H11可以減少巨噬細胞中脂質的沉積。3)通過對化合物庫的篩選，發現了一種化合物GYY4137可顯著減少ApoE基因敲除小鼠的AS面積，并改善主動脈舒張功能；對血漿膽固醇和HDL沒有影響卻可降低TG水平。4)糖尿病患者的HDL能顯著增加內皮細胞環氧化酶2（COX2）表達，促進了PGI2的釋放，表現為對AS的代償性保護作用。5)構建了新的具有HDL受體功能的ATP合酶腺病毒載體，將應用于已知HDL載體SRB1基因敲除小鼠研究，從而發現HDL功能異常的新機制。6）在前期工作中，已經解決了技術難題，成功制備了高TG的ApoCIII轉基因小鼠、家兔和小型豬。第四部分含硫氨基酸家族在動脈粥樣硬化發生中的炎癥和免疫調節作用及分子機制學術思路與技術途徑：本課題采用系統生物醫學的觀念和手段，特別采用功能蛋白質組學分析的方法，以血管細胞和管周脂肪細胞及免疫細胞（巨噬細胞，T細胞，樹突狀細胞）為對象，探討關鍵炎性因子的主要來源及其受含硫氨基酸家族調控的機理，闡明細胞內起關鍵作用的蛋白質靶分子及其修飾機制。最后在整體AS動物模型乃至臨床病人中，探討血管局部炎癥和抗炎癥系統如何失衡從而介導了血管慢性炎癥的發病機制，并改變關鍵蛋白靶點后進行功能驗證。以尋找出主要慢性炎癥生物標記物與含硫氨基酸家族作用的主要途徑，分析環境致病因素單獨或協同作用引起相同或相似的動脈血管損傷的原因，以及同一致病因素在不同人群和個體引起不同損傷的炎癥和抗炎癥機制，為發現具有抗動脈硬化慢性炎癥潛在藥物的作用靶點奠定基礎。研究創新性：含硫氨基酸家族代謝成員間的動態平衡關系以及它們的效應間的“網絡”調節兩個層面出發，探索AS的炎癥免疫發病新的調控機制。可行性分析：國內合作十年已經形成了包括本課題主要成員在內的從內源性含硫氨基酸家族（代謝同源分子），包括Hcy與H2S及其主要代謝酶在AS發生、發展中的作用的精良的研究隊伍；本課題組已經在國內建立了很好的學科交叉和優勢互補合作研究，包括在蛋白質組學和系統生物學以及分子病理生理學和臨床研究的優秀團隊，用新的思維和新的研究模式對內源性含硫氨基酸家族（代謝同源分子）代謝物存在和功能展開全面研究；本課題主要承擔和合作單位均具有良好的蛋白組學平臺和系統生物學平臺以及工作經驗；本課題組還擁有研究所需的多種轉基因和基因敲除AS實驗動物模型，為工作的順利開展提供了必要條件。第五部分血管重塑與動脈粥樣硬化發生發展的分子機制學術思路與技術途徑：本課題建立和優化心肌橋物理仿真模型，探索內皮損傷導致血管重塑造成血管再狹窄分子機制，研究如何在抗再狹窄-內皮修復-血管正性重構-遠期預后支架尋求平衡點，闡明外膜的細胞成分對于應答血管損傷和導致血管重塑的具體的分子機制。1.以內皮細胞作為工作重點，檢測不同AS模式動物內皮細胞在不同剪切應力作用下的功能變化，內皮細胞如何感應機械剪切力，并把機械信號轉變為分子信號傳遞到核內并引起一系列下游事件改變。2.基于生物醫學工程建立心肌橋物理仿真模型，搭建研究心肌橋近段壁冠脈易發AS的研究平臺，探索該處復合應力對內皮細胞結構功能的影響，闡明橋近段冠脈易發AS分子機理，為心肌橋是否能成為AS新的解剖因素提供理論依據。3.在藥物支架抗再狹窄-內皮修復-血管正性重構-遠期預后鏈中尋求平衡點，尋求在血管過度正性重塑中具有預報價值的信號分子；通過新型的影像學檢測手段跟蹤藥物支架植入后血管重構的影像學特征，探索并構建早期篩查再狹窄和晚期支架內血栓及貼壁不良風險預報的臨床參數系統。4.以血管外膜為研究對象，研究成纖維細胞分泌因子的相互作用及其信號通路；從細胞及器官水平闡明外膜在血管重塑中的作用，尋找新的干預靶點。特色與創新性：心肌橋物理仿真模型逼真模擬符合體內不同程度的心肌橋模型；率先進行藥物支架內皮化的分子調控研究和藥物支架涂層材料分子生物學研究；識別血管外膜產生的血管活性因子，探索調控細胞分化和表型轉化的機制，以確定外膜在AS發生中的地位。可行性分析：本課題組已經從國外引進SMS2KO小鼠、SMS2LTg小鼠等AS模式動物，與本項目有關的關鍵設備層流切應力平行板裝置由上海理工大學研制，能保證細胞受到不同水平的恒流剪切力作用，經過10多年的使用和不斷完善，具有更好的可比性和穩定性；已經初步建立符合體內血流動力學的心肌橋模型，可以調節不同的壓迫程度；還建立了相關的內皮細胞三維培養體系，這個培養體系可以放置到心肌橋模型中進行觀察。第六部分動脈粥樣硬化斑塊不穩定性和早期防治學術思路與技術途徑：1.構建斑塊不穩定動物模型，在ApoE-/-背景下過表達促進斑塊不穩定的基因并評價其作用。2.利用構建的斑塊不穩定動物模型，研究免疫炎癥和氧化應激對于斑塊不穩定性的影響及其分子機制。3.同時研究調節血管內皮細胞凋亡的關鍵因子在斑塊不穩定性的作用以及信號轉導網絡。4.比較穩定和不穩定斑塊中主要細胞成分組蛋白修飾狀態的差異，尋找不穩定斑塊組成細胞中出現組蛋白表觀遺傳學異常的分子機制以及這些組蛋白修飾差異對斑塊穩定性的意義。5.研究不同生物力學變化對血管細胞形態、排列和生物學標志物以及斑塊應變的影響。多方位探討斑塊不穩定的理化機制，尋找能夠干預不穩定性斑塊形成的新通路和新靶點。ASAS斑塊不穩定動物模型的建立及評價氧化應激對于斑塊免疫炎癥的影響比較并尋找不穩定斑塊的表觀遺傳學差異血管生物力學對易損斑塊結構的影響血管內皮細胞凋亡對斑塊不穩定的作用及機制免疫細胞和免疫調控分子影響斑塊不穩定性的機制生物信息學方法確定內皮細胞凋亡和自噬的新因子利用組學技術探討DNA甲基化和組蛋白修飾狀態的調控機制明確導致斑塊破裂的關鍵力學和分子偶聯機制不穩定斑塊干預的新通路和新節點研究的創新性：首次建立與人類不穩定斑塊病變相似的具有高自發破裂率和高血栓發生率的“雙高”ApoE-/-小鼠模型。發現的PC-PLC和ITGB4抑制劑尋找血管內皮細胞凋亡和自噬的新因子和新通路，發現凋亡和自噬信號通路的新節點。建立一種取得高純度血小板的新途徑，首次提出LPS通過血小板TLR4/PI3K/Akt信號通路引起血小板活化。首次提出針對不穩定斑塊的多因子調控網絡進行節點干預研究，提出力學與生物信號分子聯合調控斑塊易損的新機制和新思路，為防治易損斑塊提出新的干預靶點。可行性分析：本課題一直從事AS不穩定斑塊的基礎和臨床研究，承擔多項國家重大和重點研究課題，形成了以AS不穩定斑塊發生機制、預警技術和防治措施為突出特色的研究方向，已成為國內外知名的AS研究中心。主要包括：在不穩定斑塊動物模型的研究方面，本課題組已建立了斑塊破裂率高達80%的新西蘭兔模型、斑塊內出血的新西蘭兔模型以及斑塊自發破裂的ApoE-/-小鼠模型，在此領域中積累了豐富的經驗，為本課題建立“雙高”的ApoE-/-小鼠模型奠定了良好的基礎；發現10多種小分子化合物對血管內皮細胞凋亡有重要調節作用，尤其發現PC-PLC抑制劑D609可顯著抑制AS的發展，使斑塊趨于穩定，證明3BDO能抑制血管內皮細胞自噬；創建了PGHS-1和PGHS-2的基因打靶的小鼠4種變異體包括PGHS-2Y385F，PGHS-1Neo，PGHS-1>PGHS-2和PGHS-2Neo；發現了多個穩定斑塊的治療新靶點，證明不同靶點的聯合基因干擾較單一靶點的基因干擾可更有效地穩定斑塊；用不同濃度LPS刺激血小板，建立了LPS刺激血小板活化的方法，為研究血小板TLR4受體的生物學活性提供了實驗基礎；已建立了研究血管生物力學的整套實驗系統，保障了本課題的順利實施；有先進完備的蛋白質組學技術平臺和具有豐富經驗的生物信息學、轉錄組和蛋白組學領域研究人員，已建立了完善的AS患者標本數據庫，為本課題的實施提供了重要保障。

四、年度計劃年度研究內容預期目標第一年篩查AS相關基因遺傳變異。建立動脈粥樣硬化的動物模型和細胞模型以及能量限制，辣椒素處理方法和高脂誘導的方法。探討含硫氨基酸家族主要代謝產物及相應的代謝酶產生和降解等變化規律和特點。觀察含硫氨基酸家族主要代謝產物對血管和免疫細胞致炎和抗炎功能的影響和可能的機制。不同剪切應力對于內皮功能分子，細胞膜感受復合體的影響以及有關信號傳導通路的影響。以內皮為研究核心，觀察藥物支架植入后對于血管重塑的正反作用及機制。在ApoE-/-小鼠（高脂血癥遺傳背景）中給予高脂喂養（加速斑塊形成）、頸動脈放置狹窄套管（造成內皮損傷和斑塊定位）、應激狀態（造成斑塊炎癥和自發性破裂）、組織因子TF或纖溶酶原抑制物PAI-1基因過表達（造成血栓形成），應用病理學技術測量和對比穩定和不穩定斑塊的自發破裂率和血栓發生率，預期可導致“雙高”的ApoE-/-小鼠模型。篩查出潛在的與AS相關的遺傳多態位點，用于進一步鑒定。建立能量限制與特殊飲食影響動脈粥樣硬化和細胞血管功能的體內和體外模型。明確含硫氨基酸家族主要代謝產物及相應的代謝酶產生和降解等變化規律和特點；闡明其對不同細胞致炎和抗炎平衡的影響。明確內皮細胞如何感應機械剪切力，將機械信號轉變為分子信號傳遞到核內以及一系列下游事件改變。尋求在血管過度正性重塑中具有預報價值的信號分子。建立與人類不穩定斑塊病變相似的具有高自發破裂率和高血栓發生率的“雙高”ApoE-/-小鼠模型，為不穩定斑塊的發生機制和干預策略研究提供理想的動物模型。第二年綜合分析遺傳變異與急性冠脈綜合征以及中間表型的關系。在細胞水平，觀察能量限制，辣椒素和高脂處理對于血管細胞功能和斑塊形成和面積大小的影響。篩選高脂處理處理細胞引起的氧化應激、內質網應激、炎癥通路的顯著改變的靶點；采用系統生物醫學的觀念和手段尋找在高同型半胱氨酸加速動脈硬化發生和發展的慢性炎癥過程中調控的關鍵炎性因子，并進行功能驗證。建立優化心肌橋物理仿真模型。檢測心肌橋物理仿真模型對于內皮細胞形態、凋亡與增殖功能、自分泌及旁分泌功能，粘附分子、炎癥因子、細胞外基質、氧化應激相關分子等的變化情況以及基因表達譜的影響。分析POX對AS發生發展的影響；鑒定影響血管內皮細胞自噬、凋亡的新因子；分析免疫細胞和因子在不穩定斑塊的作用和機制；研究LPS誘導血小板活化的關鍵靶分子；觀察血管生物力學對易損斑塊結構的影響；研究參與斑塊細胞的全基因組表觀遺傳譜式和差異。綜合分析基因變異與急性冠脈綜合征以及中間表型的關系。發現5-10個對AS發病危險具有重要作用的位點。明確能量限制與辣椒素對于細胞，血管功能的影響和對于動脈粥樣硬化是否具有的保護/促進作用。初步完成高脂處理和髙同型半胱氨酸處理的功能基因組學和蛋白質組差異分析，篩選出炎性反應通路中的主要途徑和3-5個關鍵因子。運用此模型，探索該處復合應力對內皮細胞結構功能的影響。闡明POX活性對斑塊氧化應激和斑塊不穩定的影響及其分子機制。第三年應用分子細胞生物學技術研究重要多態的生物學功能。篩選與能量限制和辣椒素等相關的作用分子，對于能量限制和高脂飲食相關的分子構建重要分子的轉基因和基因敲除的動物模型。研究Hcy對關鍵靶分子蛋白的調控和翻譯后修飾機制,探討其受含硫氨基酸家族調控的可能機理以及分子結構學基礎。闡明心肌橋對不同節段內皮細胞變化及其機制。尋找引起內皮細胞變化的關鍵因素，建立血流動力學評估系統。觀察藥物支架植入后，內皮細胞和平滑肌細胞在重塑中的交互作用。分析POX對AS易損斑塊的影響；研究影響血管內皮細胞自噬、凋亡特異性胞內信號通路；分析免疫調控分子在斑塊不穩定性中的作用和機制；分離、鑒定活化血小板中特異的磷酸化蛋白和磷酸化位點；觀察不同剪切力分布的斑塊局部炎癥因子和膠原的測量；研究全基因組表觀遺傳譜式和分析差異生物信息學數據確定重要多態在AS斑塊進展中的生物學作用。找到3-5個與能量限制與特殊飲食相關的重要調控分子。明確不同細胞中，Hcy和H2S對靶蛋白分子的調控修飾機制。闡明橋近段冠脈易發AS分子機理，為心肌橋是否能成為AS新的解剖因素提供理論依據。明確血管內皮細胞自噬與斑塊不穩定性的關系及其機制，發現控制血管內皮細胞自噬的新因子，揭示炎癥因子引起血小板活化的信號轉導通路，明確干預血小板活化的關鍵靶點，尋求有效預防血栓形成的策略，揭示炎癥引起血小板活化的信號轉導機制。第四年1. 結合遺傳學找到的遺傳變異位點，能量限制、脂質代謝紊亂以及髙同型半胱氨酸研究中找到的關鍵分子，研究其生物學功能，并找出其相互作用分子和上下游信號分子，分別構建分子作用小網絡。2. 采用新型的影像學檢測手段跟蹤藥物支架植入后血管重構的影像學特征。探索支架在如何防止過度重塑。3. 觀察系統性POX分析花生四烯酸代謝對易損斑塊的影響；利用SiRNA、特異性阻斷劑、轉基因/基因敲除觀察對易損斑塊的影響；觀察免疫抗體誘導或基因敲除阻斷觀察免疫細胞對易損斑塊的影響；研究LPS誘導血小板活化的關鍵和有效靶點；篩選機械力與斑塊破裂有關的關鍵因子和作用靶點；篩選表觀遺傳差異調控斑塊破裂相關的關鍵作用因子。探討AS重要相關基因變異的分子遺傳機制。初步明確重要調控分子起作用的信號網絡。探索并構建早期篩查再狹窄和晚期支架內血栓及貼壁不良風險預報的臨床參數系統。明確力學改變對斑塊炎性因子、膠原代謝和血管新生的影響及其分子機制和信號轉導通路，闡明導致斑塊破裂的關鍵力學和分子偶聯機制第五年結合急性冠脈綜合征病例對照和AS高危人群的前瞻性研究，評價遺傳變異及其聯合作用與AS評價指標間的關系。用于指導AS早期預警、風險評估和個性化防治。對于能量限制機制、脂質代謝紊亂機制、高同型半胱氨酸機制中發現的關鍵調控分子，從臨床獲得標本，分析這些分子與臨床表型的關系；明確該分子是否可作為AS的生物標記物和診防治的靶點。研究血管外膜對血管收縮/舒張功能的影響。闡明血管外膜損傷過程中的反應及其基因蛋白表達變化對血管重塑中的作用，為尋找新的干預靶點奠定基礎。在已知的多種黏附、趨化、炎癥和細胞因子中，利用單一和聯合基因過表達或基因干擾等方法，確定干擾的新靶點；比較穩定和不穩定斑塊中主要細胞成分組蛋白修飾狀態的差異，探討表觀遺傳機制。評價遺傳變異及其聯合作用與動脈粥樣硬化評價指標間的關系。篩查出1-2個AS早期預警遺傳標記。尋找可用于AS新的相關分子；確定新的抗AS靶點分子，明確其功能及臨床意義；申請國內外專利。明確成纖維細胞分泌因子的相互作用及其信號通路。從細胞及器官水平闡明外膜在血管重塑中的作用，尋找新的干預靶點。建立具有國際先進水平的斑塊穩定性的基礎研究和防治體系，圍繞動物模型、內皮功能、氧化應激、炎癥免疫、血小板活化、生物力學和蛋白組學等七個方面，提出穩定斑塊的新理論、新觀點和防治新靶點。

一、研究內容AS是多基因，多因素，多階段，長時程的疾病。AS的發病受遺傳因素和內外環境的影響。AS受多個微效基因的影響，有家族史的人易發生AS；內外環境因素可誘發脂類平衡紊亂和炎癥免疫反應，脂類沉積到內膜下，引起炎性細胞浸潤，血管內膜增厚，斑塊形成，長期積累效應使血管重塑，管腔狹窄，阻礙血流，器官功能發生障礙；不良環境因素的刺激可能誘發斑塊不穩定而破裂，產生心梗和腦卒中等并發癥。根據我國國情，遵循基礎與臨床緊密結合的方針，設置課題方向為1）中國人動脈粥樣硬化遺傳分子基礎；2）內外環境因素影響動脈粥樣硬化發生發展的分子機制；3）脂代謝紊亂導致動脈粥樣硬化發病的分子機制；4）含硫氨基酸家族在動脈粥樣硬化發生中的炎癥和免疫調節作用及分子機制；5）血管重塑與動脈粥樣硬化發生發展的分子機制；6）動脈粥樣硬化斑塊不穩定性和早期防治。第一部分中國人動脈粥樣硬化遺傳分子基礎關鍵科學問題：本研究綜合全基因組關聯研究數據和多個代謝通路相關基因網絡，闡明AS發生發展過程中不同亞臨床和臨床表型遺傳因素的作用，并最終闡明其分子遺傳機制，為AS發生的早期預警提供依據。主要研究內容：1.綜合全基因組關聯研究數據和多個代謝通路相關基因變異信息，開展大規模多階段的驗證研究，篩查和鑒定我國人群AS疾病新的易感基因和遺傳標記。2.應用分子生物學、細胞生物學、動物模型等手段，研究基因變異對基因表達或生物學功能的影響，明確新的易感基因或遺傳標記的遺傳分子機制。3.采用分子影像學和冠脈造影等技術手段檢測正常人和高危人群的血脂水平、血栓形成、斑塊鈣化分級、頸動脈內中膜厚度、脈搏波速度和冠脈狹窄程度等AS相關亞臨床和臨床表型以及中間表型，動態和系統評價多種代謝通路基因間相互作用的遺傳網絡在AS發生、發展以及斑塊穩定性及斑塊進展程度的作用。4.在大規模前瞻性研究中評估驗證遺傳標記和環境因素的預警價值，建立AS發生發展的風險預測模型，尋找早期診斷、危險分層及臨床干預的關鍵靶點。第二部分內外環境因素影響動脈粥樣硬化發生發展的分子機制關鍵科學問題：在前期研究基礎上，深入探討能量限制和特殊飲食等內外環境因素對AS發生發展的影響；研究這些因素起作用的表觀遺傳調節等的分子及其作用機制，構建作用小網絡；并探討關鍵分子作為防治診靶點的可能性。主要研究內容：1.觀察能量限制、辣椒素和黃酮類物質的作用。在細胞水平，觀察能量限制，辣椒素及黃酮類物質對于血管細胞功能的影響。在動物水平，觀察辣椒素及黃酮類物質對斑塊形成和面積大小的影響。2.用不同飲食因素處理，尋找與AS發生發展過程相關的表觀遺傳調節的分子。3.對于已發現的Sirtuins基因家族和新發現的分子，構建轉基因動物和基因敲除鼠，觀察其對AS的影響，闡明其功能和作用機制。在細胞水平，觀察對于不同類型細胞的功能的影響，包括內皮細胞的衰老狀態和舒張功能，平滑肌細胞的增殖、凋亡、分泌和遷移功能，巨噬細胞的吞噬功能和脂質反向轉運功能。明確這些分子起作用相關的表觀遺傳機制和信號通路，構建作用小網絡。4.對于研究中發現起作用的關鍵分子，探討其作為診防治靶點的可能性。獲取臨床標本，觀察AS發病與關鍵分子的表達是否存在相關性；分析關鍵分子的激活劑或抑制劑是否抑制或促進AS的發生發展。通過這些明確該分子是否可作為AS診防治的靶點。第三部分脂代謝紊亂導致動脈粥樣硬化發病的分子機制關鍵科學問題：高TG伴低HDL是國人脂代謝紊亂的主要表型，本研究在前期工作基礎上進一步闡明富含TG脂蛋白和低HDL誘發AS的途徑及其作用機制，尋找防治AS的新靶點；明確干擾泡沫細胞形成的關鍵分子清道夫受體胞漿域功能來逆轉AS的可能性。主要研究內容：1.應用原代培養的血管內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞，與不同的富含TG脂蛋白（乳糜微粒，乳糜微粒殘體，極低密度脂蛋白，極低密度脂蛋白殘體）培養后，以氧化應激和炎癥通路矩陣PCR和蛋白組學方法，確認特異性的氧化應激途徑，并應用RNA干擾、特異性抗體和特異性激動和阻斷劑，對脂質沉積、細胞活化、增值和凋亡等AS病變的細胞生物學終點進行干預分析；應用LPL基因缺陷以及ApoCIII轉基因的高TG模型小鼠，與ApoE和LDL受體缺陷的AS易感小鼠交配后，分別喂飼高脂食物以及通過動脈壁損傷加速AS形成，在不同的時間分別取動脈、心臟和肝臟，以基因組、蛋白組和脂質組學等系統生物學手段，檢測和分析這些與AS密切相關組織的氧化應激通路、炎癥通路以及脂代謝通路中相應的改變。并應用高TG的ApoCIII轉基因家兔和小型豬進一步驗證。在此基礎上選擇數個干擾靶點，進行實驗性治療。同時尋找具有對高TG所致AS嚴重度有預測生物標識物，并在相應的臨床病人中進行驗證。2.通過分析II型糖尿病患者的HDL蛋白組學，以及與內皮細胞孵育后細胞基因組和蛋白組的變化，以COX2的表達與活性改變為終點，明確和驗證II型糖尿病患者HDL促進內皮環氧合酶2（COX2）的分子機制及其對AS代償性影響的生理意義。3.發現和驗證AS病變中泡沫細胞形成的新機制，制備干擾清道夫受體胞漿結合域功能的GRP78的轉基因小鼠模型，以驗證在AS易感小鼠體內是否能夠減緩AS病變的形成，并應用從多肽庫篩選得到的干擾清道夫受體胞漿結合域功能的多肽H11，進行AS實驗性治療，為臨床防治AS提供新的措施。第四部分含硫氨基酸家族在動脈粥樣硬化發生中的免疫和炎癥調節作用及分子機制關鍵科學問題：在以往長期系列研究的基礎上，以含硫氨基酸家族代謝產物之間形成的網絡，特別以Hcy與H2S為核心造成的致炎與抗炎作用之間調控機制為主軸,研究它們與重要蛋白質的相互作用機理及重要靶蛋白修飾的特點和規律,闡明它們在AS發生和發展不同階段中的作用及機制。主要研究內容：采用高通量的翻譯后修飾位點的篩選方法，探索含硫氨基酸家族主要成員是否通過對血管細胞和免疫細胞膜或細胞內與炎癥調控相關的特定靶分子進行翻譯后修飾,促使或減緩AS發生發展。從內源性含硫氨基酸家族成員間的動態平衡關系和其效應間的“網絡”調節關系中探尋拮抗高同型半胱氨酸引起的血管慢性炎癥損傷的內源性保護小分子物質。1.在高同型半胱氨酸加速高脂引起的動脈硬化發生和發展的慢性炎癥過程中,含硫氨基酸家族主要代謝產物和代謝酶的變化規律，特別是它們產生和降解的特點。2.含硫氨基酸家族主要代謝產物對血管和免疫細胞致炎和抗炎功能的影響和機制，特別是探討它們引起血管炎癥和免疫細胞變化的靶蛋白翻譯后修飾機制以及分子結構學基礎。3.含硫氨基酸家族主要代謝產物（Hcy和H2S）及其主要代謝酶(通過改變其基因和抑制蛋白的活性)在AS發生、發展及治療中的作用；重點研究血管內皮、血管外膜成纖維及脂肪細胞與不同免疫細胞在上述AS病變發生和發展中的關鍵起始作用機制和對關鍵靶分子蛋白的調控和修飾機制。第五部分血管重塑與動脈粥樣硬化發生發展的分子機制關鍵