甲狀腺結節穿刺標本中BRAFV600E突變檢測的臨床意義張玲;周曉燕;陳穎;張皓;高麗麗;王宇;稽慶海;平波;朱曉麗【摘要】背景與目的:在甲狀腺乳頭狀癌(papillarythyroidcarcinoma,PTC)中,BRAFV600EBRAFV600E(fine-needleaspirationcytology,FNACBRAFV600EBRAFV600E20166-20174563BFNACBRAFV600EQIAampDNAMiniKitDNA,并用突變特異性擴增系統(amplificationrefractorymutationsystem,ARMSBRAFV600E:563FNAC,ARMS99.31.0:3.7,平均年齡(45.0±0.9)209PTC86.6100.0BRAFV600EPTC92.1100.0％.FNACBRAFV600EPTC11BRAFV600E9PTC.結論:ARMSFNACBRAFV600EBRAFV600E【期刊名稱】《中國癌癥雜志》【年(卷),期】2019(029)003【總頁數】5頁(P178-182)【關鍵詞】甲狀腺乳頭狀癌;細針抽吸細胞學檢測;BRAFV600E突變檢測【作者】張玲;周曉燕;陳穎;張皓;高麗麗;王宇;稽慶海;平波;朱曉麗【作者單位】200032200032【正文語種】中文【中圖分類】R736.1甲狀腺癌是最常見的內分泌系統惡性腫瘤，其發病率近年來快速上升［1］。目前，甲狀腺細針抽吸細胞學檢查（fine-needleaspirationcytology，FNAC）以其微創、易行及準確率高的特點，成為臨床上診斷甲狀腺結節良惡性最常用的方法，但仍有20%的病例無法明確診斷［2］。在甲狀腺乳頭狀癌（papillarythyroidcarcinoma，PTC）中，BRAFV600E突變是迄今報道最多的突變類型［3-5］。檢測B超引導下甲狀腺結節穿刺細胞中的BRAFV600E突變可輔助細胞學診斷，提高診斷的靈敏度和準確率。突變特異性擴增系統（amplificationrefractorymutationsystem，ARMS）方法利用特異性引物和雙環探針技術，將BRAFV600E檢測靈敏度提高到1%的突變比例，大幅提高了檢出率。本研究使用該方法對甲狀腺穿刺細胞液進行BRAFV600E突變檢測，以組織病理學診斷為金標準，評估BRAFV600E檢測與細胞學診斷的靈敏度和特異度。材料和方法材料研究對象20166—20174B563BRAFV600E主要試劑與設備QIAampDNAMiniKit試劑盒購自德國QIAGEN公司，人類BRAFV600E突變檢測試劑盒購自廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司。Eppendorf5810R低速離心機購自德國EppendorfAG公司，Thermo-Shaker恒溫金屬浴購自美國ThermoFisherScientific公司，QIAcube核酸提取儀購自德國QIAGEN公司，ThermoNANOdrop2000核酸濃度測定儀購自美國ThermoFisherScientific公司，ABI7500實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-timefluorescencequantitativepolymerasechainreaction，RTFQ-PCR）LifeTechnologies方法DNA穿刺細胞液用Eppendorf5810R低速離心機4000r/min離心30min，去上清液，吸取沉淀加入裂解液放入Thermo-Shaker恒溫金屬浴56℃消化過夜。用QIAcube核酸提取儀提取DNA，用ThermoNanoDrop2000核酸濃度測定儀進行定量，并將濃度統一稀釋至2ng/μL。RTFQ-PCRRTFQ-PCR35μL8DNA5μL4000r/min15～20sABI7500RTFQPCRRTFQ-PCR：955min，1（第一階段）；9525s，64℃20s，72℃20s，15個循環（第二階段）；93℃25s，60℃35s，72℃20s，31個循環（第三階段）。信號收集：第三階段60℃時收集突變FAM和內控HEX（或VIC）信號，執行RTFQ-PCR，保存文件。BRAFV600EThresholdFAMHEX（VIC）CtHEX（VIC）Ct13～21Ct21HEXRTFQ-PCRDNADNAFAMCt28，該樣BRAFV600ECt13，說明加DNADNAFAMCt28BRAFV600EFAMCt20，但可能會由于不同儀器的不同閾值設置而發生波FAMCt≥28，則樣本為陰性（或低于試劑盒的檢測下限）；FAMCt28，則樣本為陽性。統計學處理采用SPSS19.0統計學軟件對數據進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。2結果在563例進行BRAFV600E突變檢測的患者中，男女比例為1.0∶3.7（120∶443），年齡1～79歲，平均年齡（45.0±0.9）歲（表1）。BRAFV600E檢測成功率為99.3%（559/563），4例檢測失敗，無法判斷結果（ARMS方法檢測無HEX峰升起，提示擴增失敗），BRAFV600E的總體突變率為50%。將標本按細胞學診斷分為6級，其中良性32例，未見腫瘤細胞182例，4296PTCPTC292例。表1甲狀腺結節FNAC標本中BRAFV600E突變檢出率、細胞量及DNA濃度Tab.1BRAFV600Emutation,cellnumberandDNAconcentrationintheFNACsamplesofthyroidnoduleCytologicaldiagnosisNGender(male∶female)Age/yearCellnumber＞60DNAconcentrationρB/(ng·μL-1)BRAFV600EmutationBenign326∶2623-61(mean46.0±3.1)71.4%(15/21)1.5-21.9(mean7.3±1.9)3.2%(1/31)Tumorcellsundetermined18231∶15119-80(mean48.0±1.6)28.3%(34/120)1.2-115.3(mean7.0±1.6)7.7%(14/181)Atypicallesions4210∶3227-67(mean46.0±3.1)50.0%(16/32)1.1-25.8(mean6.2±1.7)33.3%(14/42)Individualatypicalcell90∶926-52(mean39.0±6.2)40.0%(2/5)2.4-10.2(mean5.2±2.4)66.7%(6/9)Suspiciousforafollicularneoplasm61∶531-46(mean38.0±9.8)50.0%(3/6)1.6-17.4(mean9.1±6.9)40.0%(2/5)PTC/suspiciousforPTC29272∶22016-79(mean43.0±1.3)85.3%(174/204)1.1-85.7(mean9.0±1.1)82.1%(239/291)Total563120∶44316-79(mean45.0±0.9)62.9%(244/388)1.1-115.3(mean7.3±0.8)50.0%(280/559)388例FNAC標本做細胞量評估，樣本總體均數可信區間為95%，細胞量評估＞60DNA（9.0±1.2）ng/μL，細胞量評估＜60DNA（6.0±1.7）ng/μL，10ng/μLt（P＞0.05）。209BRAFV600EPTC86.6%，10010020.6%。BRAFV600E78.2100.0%，陽性預測值為100.013.7%。FNACBRAFV600EPTC92.1%，特異度為100.0%，陽性預測值為100.0%，陰性預測值為30.4%（表2）。FNACBRAFV600EFNACBRAFV600E（P＜0.005）。PTC11V600E9PTC，2PTC，460，32BRAFV600ETab2ComparisonofcytologicaldiagnosisandBRAFV600EdiagnosiswithhistopathologicdiagnosisHistopathologicdiagnosisItemSensitivity/%Specificity/%MalignancyBenignFNAC+175086.6100.0-277BRAFV600E+158078.2100.0-447FNAC+BRAFV600E+186092.1100.0-1673討論PTC80%［6］，近年PTCBRAFV600E異常，突變率為45%～80%［7-8］。BRAFV600E突變后可持續性激活Ras基因/絲蘇氨酸蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶激酶/絲裂原活化蛋白激酶（Ras/serine/threonine-proteinkinase/mitogenactivatedproteinkinasekinase/mitogen-activatedproteinkinase，Ras/Raf/MAPKK/MAPK）信號通路促使甲狀腺細胞增殖，使濾泡上皮細胞發生惡變，并可促進高分化乳頭狀癌細胞發展為低分化和未分化癌細胞［9］。目前甲狀腺結節穿刺的細胞學診斷是術前良惡性診斷的重要手段，但是約20%的甲狀腺FNAC標本細胞學無法明確診斷［10-13］，其惡性風險度為1.7%～6.6%［14］，該組患者常需要再次穿刺或易漏檢。因此，有學者開始將分子檢測應用FNACFNACARMSBFNACBRAFV600E99.3%，方法簡便快速，適用于臨床術前輔助診斷。本研究中，評估比較細胞量＞6060FNACDNA10ng/μL，差異無統計學意DNA4BRAFV600EDNAARMSDNA86.6BRAFV600E92.1BRAFV600EBRAFV600E11BRAFV600E9PTC，說明在微小PTCBRAFV600EDNAPTC，BRAFV600E漏檢率。FNACARMSBRAFV600EBRAFV600EFNAC［參考文獻］【相關文獻】［1］ELISEIR,MOLINAROE,AGATEL,etal.Aretheclinicalandpathologicalfeaturesofdifferentiatedthyroidcarcinomareallychangedoverthelast35years?Studyon4187patientsfromasingleItalianinstitutiontoanswerthisquestion［J］.JClinEndocrinolMetab,2010,95(4):1516-1527.［2］張博茗,林元強,隋國慶,等.細針穿刺細胞學聯合BRAFV600E基因突變檢測在甲狀腺結節診斷中的價值［J］.腫瘤影像學,2015,24(4):259-263.［3］PARKKS,OHYL,KICS,etal.Evaluationofthereal-QBRAFV600Edetectionassayinfine-needleaspirationsamplesofthyroidnodules［J］.JMolDiagn,2015,17(4):431-437.［4］GUERRAA,DICV,GARZIA,etal.DiagnosticutilityofBRAFV600Emutationtestinginthyroidnodulesinelderlypatients［J］.BMCSurg,2013,13(Suppl2):S37.［5］ZHUX,LUOY,BAIQ,etal.SpecificimmunohistochemicaldetectionoftheBRAFV600Emutationinprimaryandmetastaticpapillarythyroidcarcinoma［J］.JExpMolPathol,2016,100(1):236-241.［6］DAVISL,WELCHHG.CurrentthyroidcancertrendsintheUnitedStates［J］.JAMAOtolaryngolHeadNeckSurg,2014,140(4):317-322.［7］漢鋒,張彬.基因突變與甲狀腺癌診斷及預后［J］.國際耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2013,37(4):234-236.［8］朱曉麗,周曉燕,朱雄增.甲狀腺乳頭狀癌中BRAFV599E點突變與RET/PTC融合基因的檢測［J］.中華病理學雜志,2005,34(5):270-274.［9］羅書畫,周揚,龔日祥.BRAF基因與甲狀腺癌［J］.現代預防醫學,2007,34(1):64-66.［10］CIBASES,ALISZ.TheBethesdaSystemforReportingThyroidCytopathology［J］.AmJClinPathol,2009,132(5):658-665.［11］YASSAL,CIBASES,BENSONCB,eta1.Long-termassessmentofamultidisciplinaryapproachtothyroidnodulediagnost