電泳技術一、基本理論1.常用公式和術語E=U/L

電場強度(V/cm)=電壓(V)/電極間距(cm)*相對遷移率mR=蛋白質遷移距離/示蹤染料遷移距離μep=v/E=l/(tE)=lL/(tU)=q/(6πrη)(cm2/(s*V)∵F=qE=F’=6πrηv l：蛋白質遷移距離電泳速度 v=μepE=μepJ/K

分離度影響電泳的環境因素電泳速度v=μepE=εζE/(Cη)C:6πor4πEpH:pI(~4-7),緩沖溶液pH(~8-9.5),向？極泳動離子強度I:0.02-0.2電滲溫度：焦耳熱介質：孔徑、制膠重復性等2.分類按原理:區帶電泳,(移界電泳),穩態電泳,顯微電泳3.電泳儀及附屬設備提供穩定直流電源的裝置電壓、電流、電功率穩定脈沖式電壓 常壓電泳儀(600V):凈電荷和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳高壓電泳儀(3kV):載體兩性電解質等電聚焦電泳和DNA測序超高壓電泳(30-50kV):毛細管電泳電泳槽板狀電泳槽水平板垂直板管狀電泳槽*自由界面電泳槽DYCP-33A型瓊脂糖水平電泳儀(槽)(中號)DYCZ-22B型

單垂直電泳儀(槽)（大號）

4.電泳的支持介質特性（要求）物理化學性質穩定化學惰性 均勻

種類分離原理特性物質薄膜類電荷密度化學惰性對流擴散小紙、醋酸纖維素薄膜、聚酰胺薄膜凝膠類電荷密度分子大小同上+多孔性分子篩效應（淀粉）、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、新型凝膠介質5.檢測-染色方法考馬斯亮藍：常用熒光染料：靈敏硝酸銀：靈敏酶活性免疫學：專一特殊蛋白質糖蛋白、脂蛋白、鐵蛋白、銅蛋白三苯基甲烷衍生物，-SO3--蛋白質的堿性基團——染料-蛋白質復合物。R型G型二甲花青亮藍-甲基取代的三苯基甲烷衍生物染色固定蛋白質-染色-脫色同時固定和染色-脫色脫色30%甲醇的10%乙酸溶液等二、瓊脂糖凝膠電泳

agarosegelelectrophoresis支持介質：瓊脂糖結構：1,3連接的β-D半乳糖和1,4連接的3,6脫水α-D半乳糖線性聯結成瓊脂糖，瓊脂糖之間以分子內和分子間氫鍵形成交聯結構特點：大孔膠，適于核酸、線性DNA,RNA分離分析分離原理：0.2-50kb操作形式：水平電泳、免疫電泳、平板等電聚焦AgaroseD-galactose3,6-anhydroL-galactose性能指標電內滲、膠凝溫度、熔化溫度、凝膠強度、脫水收縮作用純度：硫酸根含量少，純度高應用：核酸研究,不同濃度凝膠分離200bp-50kbDNA檢測：熒光染料溴乙啶，電泳后染色操作過程：見AgaroseGelElectrophoresis.ppt三、醋酸纖維素薄膜celluloseacetatefilm纖維素-乙酰化特點定量準確性提高：吸附少、染色背景脫色較快速：電滲小靈敏度高，樣品用量少：5微克蛋白質薄膜可保存操作簡單快速價廉應用領域：血漿蛋白、脂蛋白、糖蛋白、脫氫酶、多肽等四、聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE以polyacrylamidegel為分離介質分離原理：電荷密度+分子篩特點應用領域操作形式(圓盤電泳)垂直板電泳水平板電泳1.聚丙烯酰胺凝膠polyacrylamidegel,PAG聚合化學聚合光聚合總濃度與交聯度單體 交聯劑 催化劑丙烯酰胺+ N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺 ————PAGAcr Bis 加速劑過硫銨(AP)-化學聚合

or核黃素VB12–光聚合N,N,N’,N’-四甲基乙二胺TEMED反應影響因素產物特點應用濃度、比例、pH、溫度、含氧、雜質等孔徑較小分離膠光照條件孔徑較大濃縮膠總濃度與交聯度的影響凝膠濃度

T=[(a+b)/m]100%

(g/mL)交聯度 C=[b/(a+b)]100%a=mAcr;b=mBis;m=Va/b：凝膠性狀、孔徑、分子篩效應等C=6.5-0.3T濃度篩選：標準凝膠T=7.5%或梯度膠凝膠孔徑CTnm1515256.62.41.92.88.02.31.62.43.610.01.91.42.03.012.01.7915.01.47蛋白質相對分子量適用凝膠濃度蛋白質相對分子量適用凝膠濃度<1萬20-3010-50萬5-101-4萬15-20>50萬2-54-10萬10-152.連續聚丙烯酰胺凝膠電泳(1959)凝膠孔徑、緩沖液（樣品、凝膠、電極）不變分離原理：樣品電荷特點：制膠簡單、條件簡單恒定、分辨率不高適用：簡單樣品3.不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳含義：不同膠孔徑、不同緩沖液分離原理：電荷效應+分子篩效應特點：樣品成分濃縮-分離，分辨率高；操作復雜適用：廣泛應用的主要電泳技術3種物理效應樣品濃縮；分子篩效應；電荷效應不連續性凝膠濃度：濃縮膠-分離膠緩沖液離子成分緩沖液pH電位梯度制膠分離膠

樣品膠濃縮膠抽氣濃縮膠儲液:2(10%Arc+2.5%Bis)1.0mol/LTris-HCl緩沖液pH6.8:140%蔗糖:4TEMED:0.0054mg/100mLVB120.001水封靜置蒸餾水:4.930%凝膠儲液:2.5(29.1%Arc+0.9Bis%)1.5mol/LTris-HCl緩沖液,pH8.9:2.510%Ap:0.05TEMED:0.006水封靜置抽氣25mmol/LTris+192mmol/LGly緩沖液pH8.3-+4.SDS十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離原理:分子篩-分子相對分子質量蛋白質-SDS復合物呈棒狀且大量帶電(-),消除樣品蛋白質分子間電荷差異應用：蛋白質純度檢測和相對分子量測定操作形式：多用垂直管或垂直板，不連續系統，或梯度膠SDS操作特點樣品:制膠：緩沖液：分離、濃縮膠緩沖液均含SDS等分子量的確定染色考馬斯亮藍-蛋白質吸附量-近似Beer定律其他染色計算標準蛋白質mR，作lgMr-mR標準曲線待測蛋白mR-Mr同時測定5.梯度凝膠電泳分離膠濃度為線性或指數梯度分離原理：蛋白質分子大小T4-30%,Mr5萬-200萬，分辨較小Mr差異可不與SDS反應，與SDS互補常加入SDS制膠：梯度混合器五、等電聚焦電泳isoelectricfocusingIEF分離原理：利用pH梯度的介質分離pI不同的蛋白質分辨率pI相差0.01-0.001適用研究蛋白質微觀不均一性測定蛋白質等電點操作形式:水平平板、(管式)獲得pH梯度人工pH梯度:不穩定，可用于制備自然pH梯度載體兩性電解質：一系列pI不同的多氨基多羧基混合物(合成過程產生連續變化的氨基羧基比)不同pH范圍NH2-R-COO-——NH2-R-COOH——NH3+-R-COOH-高pH電極液+低pH電極液高pI不同pI混合物低pI高pH兩性緩沖低pH等電聚焦支持介質聚丙烯酰胺應用較多避免分子篩作用薄膜-散熱與經濟加樣方式放大作用檢測固定脫色：除去兩性電解質染色六、雙向電泳2DE第一次電泳后，在垂直方向再進行一次電泳單向電泳100種蛋白質雙向電泳5000-8000種蛋白質(圓點)組合方式：第一向等電聚焦(pI)，第二向SDS-聚丙烯酰胺均勻/梯度膠電泳(Mr分離)為多I.E.F.and2DGE/article_info.php/articles_id/65/ch2d/七、蛋白質印記將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品分離：高分辨電泳技術檢測