Odyssey紅外激光成像系統

—蛋白研究的多功能平臺WesternBlot常見檢測方法化學顯色法:靈敏度低，無法定量。放射自顯影法：對身體有害，操作復雜。化學發光法:無法精確定量，操作復雜。抗原一抗結合紅外熒光標記的二抗Infrared

dye(IRD800,Alexa680)ODYSSEY成像原理INFRAREDLASERDIODEINFRAREDAPDDETECTOR紅外熒光－準確定量TIMETIMECHEMILUMINESCENCE

動態信號－信號隨時間變化信號不與目標蛋白濃度成比例關系ODYSSEY

靜態信號－信號不隨時間變化信號和目標蛋白濃度成比例關系Highconcentration/signalMediumconcentration/signalLowconcentration/signalSaturationBackground0,00,0INTENSITY紅外熒光定量Western－DEMO實驗步驟Odyssey:膜+一抗孵育+熒光標記抗體孵育+Odyssey掃描成像ECL:膜+一抗孵育+酶聯二抗孵育+底物顯色+UVP掃描成像實驗目的檢測培養細胞轉染外源基因的表達狀況紅外熒光定量Western－DEMOMarkerS1S2S3S4MarkerS1S2S3S4Odyssey結果

ECL結果

信號強度5120104信號強度302623019（Odyssey軟件分析結果）

結論Odyssey和ECL的相對靈敏度相差不大Odyssey紅外激光成像系統具有更好的線性關系和更精確的定量結果Odyssey掃描圖能同時看到Marker和目標蛋白，ECL看不到Marker10:4:2:1稀釋OdysseyVSECL流程ECLOdyssey1跑膠跑膠2轉膜轉膜3封閉封閉4結合一抗、洗滌結合一抗、洗滌5結合酶標記二抗、洗滌結合紅外染料標記二抗、洗滌，成像6發光試劑盒7暗房曝光成像紅外熒光優點－低背景NIRDyesBiomoleculesPorphyrinsVisibleFluorophoresPAHs1000nm800600400200Allothersequencers400-650nmLI-COR700-800nm硝酸纖維,

聚偏氟乙稀（PVDF）,生物分子和尼龍等物質在可見熒光范圍內有很高的自身熒光。

紅外熒光vs可見熒光膜背景信號紅外——背景低、SN更高紅外熒光VS化學發光線性寬的成像效果

Odyssey曝光３０秒曝光１分鐘曝光５分鐘曝光１０分鐘Odyssey—雙色同時檢測800nm700nmOverlay兩套獨立激發檢測系統700通道：680nm激發720nm檢測800通道：780nm激發820nm檢測應用一：雙色－定量western檢測TargetproteinAnti-rabbit800channelNormalizertargetAnti-mouse700channel*Two-colordetectionrequiresprimaryantibodiesfromdifferenthostsEMSA的簡介EMSA(ElectrophoreticMobilityShiftAssay)凝膠遷移實驗是研究DNA與蛋白質或RNA與蛋白質相互作用的常用技術。該技術是基于DNA/蛋白質或RNA/蛋白質復合體在聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）中有不同遷移率的原理。當蛋白質與一條人工合成的特異的DNA或RNA結合后，其在PAGE中的遷移率將小于未結合的DNA，從而檢測到活化的與DNA或RNA結合的蛋白，一般為轉錄或調控因子。EMSA起初是用32P同位素標記寡核苷酸探針,但是由于同位素的放射性很強,而且半衰期為14天,從定購同位素到標記，做完試驗,必須14天完成,既不安全也不方便；地高辛標記探針的非放射EMSA實驗技術，其缺陷是標記的探針純化后靈敏度弱；紅外熒光素技術的出現，可以解決EMSA實驗中的探針示蹤問題，還可以進行雙色標記，檢測競爭性結合。應用三－雙色EMSABindingofT7RNAPtotwoDNAfragmentscontainingtheT7promotersequence,labeledwitheitherIRDye700(red)orIRDye800(green).700and800Overlay700nmChannel800nmChannelDNA-ProteinComplexUnboundDNAIRDye800UnboundDNAIRDye700In-CellWesternAssayTheOdysseyIn-CellWestern(ICW)Assayisahigh-throughputapproachtosimultaneouslydetectandquantifytwoseparateproteinsdirectlywithincells.細胞培養Culturecellstoconfluencyin96-wellor384-wellplates處理細胞Treatcells(inhibitor,stimulator,etc…)固定細胞Fixcells(3.7%formaldehyde,methanolorPrefer)透化細胞Permeabilizecells(0.1%Triton-X100)IncubatewithIRDye?secondaryantibodies(e.g.:IRDye?680andIRDye?800CW)Incubatewith2primaryantibodiesIncubatewith1primaryantibodyIncubatewithIRDye?secondaryantibodyandaDNAstain(e.g.:To-Pro-3)Odyssey系統掃描ScanplatedirectlyandanalyzeontheLI-CORInfraredImagingSystems.In-CellWestern工作流程MembraneWesternsvsICWOdyssey的擴展應用活體熒光檢測

考馬斯亮藍凝膠分析組織切片成像活體動物成像隨著醫學及生物學研究的飛速發展，越來越多的科研人員希望將分子及細胞生物學技術從傳統的體外研究延伸到活體動物體內，以直接監控活體生物體內的細胞活動和基因表達，有效地研究觀測轉基因動物生理過程，譬如活體動物體內腫瘤的生長及轉移、感染性疾病發生發展過程等。活體動物光學成像技術作為新興的成像技術以其操作簡單、結果直觀、靈敏度高、成本低等特點，成為活體動物成像的一種理想方法。

Licor紅外熒光技術的優點*極低的自發熒光干擾動物的自發熒光皮毛（黑色素）的發射光線波長峰值一般在500-520nm左右，血紅蛋白的發射光線波長峰值一般在504-540nm左右，在大于600nm的近紅外波段，活體內物質的自發熒光對于成像干擾小，背景噪音低，靈敏度高。*良好的組織滲透性組織在可見光范圍（350～600nm，脂肪&血色素）及在紅外線范圍（>900nm,水）有較高的光吸收，而在近紅外區域光吸收降到最低，采用紅外熒光檢測系統，使得組織滲透性深度從幾毫米上升到幾厘米。*無毒性和放射性，游離熒光染料清除快近紅外熒光染料基團對活體無毒性，不具有放射性，而且游離的熒光基團可以在短時間內在動物體內淬滅清除，方便后續最優化檢測。可以真正無損傷地研究各項生理指標，數據結果真實可靠。熒光活體成像的技術關鍵紅外熒光：組織和細胞對近紅外波長的光信號吸收最低紅外波段，光的散射更低在近紅外波長范圍，自發熒光更低GFPRFPIRDye?低背景高信噪比活體成像關鍵：

增加光信號的穿透性

提高檢測的靈敏度700-900nm，,組織的光吸收系數最低，能穿透幾厘米MooseImaging–Signal/BackgroundBackgroundHighS/BLowS/B紅外小動物活體成像

活體動物成像的福音2009年5月8日，Science發表錢永健教授文章：MammalianExpressionofInfraredFluorescentProteinsEngineeredfromaBacterialPhytochrome；他們在Deinococcusradiodurans（耐輻射球菌）中發現一種可吸收紅外線的蛋白質（光敏色素），研究人員對該基因進行改造，最終得出了一類紅外線熒光蛋白質，但這些蛋白質僅能發出微弱的紅外線。因此研究人員又對經過改良的光敏色素基因進行了幾輪的變異，進而選擇出了發光能力最強的一種蛋白質。研究人員將這種新熒光蛋白質的基因插入了能夠感染小鼠肝臟的一種腺病毒中。將其和膽綠素(BV)一起注射入小鼠的尾部靜脈血管，5天后，他們在嚙齒動物的肝臟中發現了紅外線熒光。新紅外蛋白質的結構，激發波長684nm,發射波長708nm，正是Odyssey700nm通道，小圖是活體小鼠發出的紅外線mKate：588nm/635nm,IFP：684nm/708nm

BV:膽綠素Ad5：腺病毒載體紅外小動物活體成像-附件LicorPearl小動物成像系統--更為專業的選擇軟件功能儀器軟件AdministrationDiagnostics應用軟件圖象控制背景扣除條帶發現和定位定量ICW%結果計算(includingnormalization)小動物活體分析試劑成本紅外二抗開放：LI-COR、Rockland、Invitrogen公司均可購買紅外二抗的成本：

與現有ECL二抗價格相當但是：紅外二抗推薦1：15,000-20,000稀釋使用，且可重復使用無需發光底物無需膠片注：ECL底物是Pierce公司（市場價），柯達膠片（市場價），國產顯影液（未計成本）；ECL二抗為SantaCruz二抗（原價）；Odyssey二抗為Licor二抗（原價）；預染Marker為CSTMarker（原價）。用odyssey掃描，預染MARKER的用量為ECL的用量的1/5－1/10。以上價格以2008年12月的各廠家的報價為準試劑一張10x10cmwesternblot的費用

Odyssey紅外熒光化學發光1color2color1colorStripandReprobe二抗

（Odyssey所用紅外二抗推薦稀釋濃度Odyssey1:15000；化學發光1:5000)48918化學發光底物試劑

(0.1ml/cm2)004892X光片及洗片試劑

(1Films/blot)002.44.8蛋白Markers（推薦用量Odyssey2uL;化學發光10uL）221010總計61069.4124.8PaperListReducedexpressionofinduciblegelatinaseB/matrixmetalloproteinase-9inmonocytesfrompatientswithmyelodysplasticsyndrome:correlationofinduciblelevelswiththepercentageofcytogeneticallymarkedcellsandwithmarrowcellularity

Blood.2007,109(1):85-92SynapticProteinDynamicsinHibernation

J.Neurosci.2007,27(1):84-92SurveillancemechanismlinkingBub1losstothep53pathway

PNAS,May2007;104:8334-8339.Biomimeticamplificationofnanoparticlehomingtotumors

PNAS,Jan2007;10.1073/pnas.0610298104.Re-introductionofC/EBPinleukemicCD34+stem/progenitorcellsimpairsself-renewalandpartiallyrestoresmyelopoiesis

Blood,May2007;10.1182/blood-2006-10