IcS.11.220n41NY中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T544-2002豬流行性腹瀉診斷技術(shù)Diagnostictechniquesforporcineepidemicdiarrhoea2002-08-27發(fā)布2002-12-01實(shí)施中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布

NY/T544-2002豬流行性腹瀉是豬的嚴(yán)重傳染病之一.癥狀與豬傳染性胃腸炎相似，病毒形態(tài)上也基本相同，但兩者的抗原性不一樣。本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)國(guó)內(nèi)研究成果和參考國(guó)外同類研究成果編寫的。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B、附錄C均為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部童牧獸醫(yī)局提出本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、中國(guó)人民解放軍軍需大學(xué)本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：馬思奇、王明、宜華、馮力、傳有恩。

NY/T544-2002豬流行性腹瀉診斷技術(shù)范園本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬流行性腹瀉（PED)的病毒分離鑒定與檢測(cè)病毒抗原的直接免疫熒光法、雙抗體夾心醇聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA).檢測(cè)抗體的血清中和試驗(yàn)、間接ELISA試驗(yàn)技術(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于對(duì)豬流行性腹瀉的診斷、產(chǎn)地檢疫及流行病學(xué)調(diào)查等。2病毒分商與鑒定2.1材料準(zhǔn)備2.1.1器材倒置顯微鏡，冷凍離心機(jī)，微孔濾器，細(xì)胞培養(yǎng)瓶，蓋玻片，溫箱等。2.1.2培養(yǎng)基及溶液的配制磷酸鹽緩沖液(PBS)、細(xì)胞培養(yǎng)液、病毒培養(yǎng)液及N-2-羥乙基哌噪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES)液（配制方達(dá)見(jiàn)附錄A）。2.1.3細(xì)胞Vero細(xì)胞系、2.2病賽分商2.2.1病料采集采采病仔豬空腸內(nèi)容物及小腸內(nèi)容物用于分離病毒.樣品冷凍保存。2.2.2病料處理將采集的小段空腸連同腸內(nèi)容物用含1000IU/ml.青雅索、1000g/mL鏈蛋素、PBS液制成5倍懸液，在4℃條件下3000r/min離心30min,取上清液，經(jīng)0.22m微孔濾膜過(guò)濾，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2.3接種及觀察將過(guò)濾液(病毒培養(yǎng)液的10%)接種于Vero細(xì)胞單層上，同時(shí)加過(guò)濾液量50%的病毒培養(yǎng)液，37℃吸附1h,根據(jù)組織培養(yǎng)瓶大小漆加病毒培養(yǎng)液至病毒培養(yǎng)總量，暨37℃培養(yǎng)，逐日觀察3d～4d，按致細(xì)胞病變作用(CPE)變化情況，可官傳2代～3代。2.3結(jié)果判定CPE變化的特點(diǎn)是:細(xì)胞面粗糙，顆粒增多，有多核細(xì)胞(7個(gè)～8個(gè)甚至幾十個(gè)),并可見(jiàn)空斑樣小區(qū)，細(xì)胞遙漸脫落，這是特征性的CPE,可與(豬)傳染性胃腸炎(TGE)病毒的CPE相區(qū)別。同時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加蓋玻片，收毒后用直接熒光做鑒定試驗(yàn)。有條件時(shí)可進(jìn)行電鏡觀察，用負(fù)染法在陽(yáng)性樣品中電鏡觀察可見(jiàn)到冠狀病毒粒子。3直接茨光抗體法3.1材料準(zhǔn)備3.1.1器材：茂光顯微鏡、冷凍切片機(jī)、載玻片、蓋玻片、溫箱、滴管等。3.1.2熒