犐犆犛６５．０２０

犅６１

中華人民共和國林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

犔犢／犜１７７２—２００８

楊樹品種分子鑒定實驗方法

犇犖犃擴增片段長度多態(tài)性法（犃犉犔犘）

犕狅犾犲犮狌犾犪狉犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉狏犪狉犻犲狋犻犲狊狅犳狆狅狆犾犪狉—

犃犿狆犾犻犳犻犲犱犳狉犪犵犿犲狀狋犾犲狀犵狋犺狆狅犾狔犿狅狉狆犺犻狊犿（犃犉犔犘）

２００８０９０３發(fā)布２００８１２０１實施

國家林業(yè)局發(fā)布

書

犔犢／犜１７７２—２００８

前言

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄Ａ為資料性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)由國家林業(yè)局提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國林木種子標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所、中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所和國家林

業(yè)局北方林木種子檢驗中心。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：李金花、張綺紋、王斌、宋紅竹、周春江、盧孟柱、李慶梅、牛正田。

Ⅰ

書

犔犢／犜１７７２—２００８

楊樹品種分子鑒定實驗方法

犇犖犃擴增片段長度多態(tài)性法（犃犉犔犘）

１范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了以楊樹新鮮組織（葉片、芽等）為材料，利用擴增片段長度多態(tài)性ＤＮＡ法（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ

ＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，簡稱ＡＦＬＰ）對楊樹品種進行分子鑒定的實驗方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于楊樹品種的分子鑒定。

２原理

楊樹基因組ＤＮＡ經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切后，形成分子量大小不等的隨機片段，將針對犈犮狅ＲＩ和

犕狊犲Ｉ的特定接頭連接在這些ＤＮＡ片段的兩端，形成帶特異接頭的ＤＮＡ片段，隨后利用一對與接頭和

鄰接酶切位點相匹配的引物進行擴增，最終通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳將這些特異性片段分離開來，

通過比較待測品種和對照品種間ＤＮＡ指紋譜帶數(shù)據(jù)的差異，來判定待測品種與對照品種是否為相同

品種。

３儀器和設(shè)備

３．１通用實驗室儀器設(shè)備。

３．２梯度ＰＣＲ擴增儀。

３．３瓊脂糖膠電泳系統(tǒng)。

３．４變性聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)。

３．５紫外透射儀。

３．６凝膠成像系統(tǒng)或照相系統(tǒng)。

３．７重蒸餾水儀。

４試劑與溶液

除非另有說明，在分析中使用分析純試劑。配制好的溶液經(jīng)高壓滅菌后使用。實驗中所使用的水

均為無菌超純水。

４．１犇犖犃限制性內(nèi)切酶犈犮狅犚犐和犕狊犲犐（１０犝／μ犔）及其１０×反應(yīng)緩沖液

－２０℃保存。

４．２犜犪狇犇犖犃聚合酶（１犝／μ犔）及其１０×犘犆犚反應(yīng)緩沖液

１０×ＰＣＲ反應(yīng)緩沖液含２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化鎂（ＭｇＣｌ２）和

５００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化鉀（ＫＣｌ），－２０℃保存。

４．３犜４犇犖犃連接酶（１犝／μ犔）及其１０×連接反應(yīng)緩沖液

１０×反應(yīng)緩沖液含３５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．６）、５０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２和５００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ和

５ｍｍｏｌ／Ｌβ巰基乙醇；－２０℃保存。

４．４四種脫氧核糖核苷酸（犱犃犜犘，犱犆犜犘，犱犌犜犘，犱犜犜犘）混合溶液（各１０犿犿狅