培養基適用性驗證

大腸埃希菌金黃色葡萄球菌（枯草芽孢桿菌

(Bacillussubtilis)

白色念珠菌(Candidaalbicans)

黑曲霉(Aspergillusniger)

備料單（菌落計數）一、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌營養瓊脂培養基200ml、*30.9%無菌氯化鈉溶液100ml*3平皿10套*31ml移液管9支*3、10ml移液管2支*3試管7支*3二、白色念珠菌、黑曲霉玫瑰紅鈉200ml、*20.9%無菌氯化鈉溶液100ml*2平皿10套*21ml移液管9支*3、10ml移液管2支*2試管7支*2菌液制備1）金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌菌液的制備接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，30℃、159r/min搖床培養24h做①代，上述培養物24h后接1ml至新鮮營養肉湯培養基中30℃、159r/min搖床培養24h做②代4）白色念珠菌菌液的制備接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基,30℃150r/min培養24小時，做①代，上述培養物24h后接1ml至新鮮改良馬丁培養基中30℃、159r/min搖床培養24h做②代5）黑曲霉菌液的制備接種黑曲霉的新鮮培養物于改良馬丁培養基上,30℃、150\min培養2天4.2適用性檢查4.2.1試驗步驟a．菌液制備：按稀釋度10-5,10-6,10-7等依次類推稀釋菌懸液，接種培養后取50～100cfu計數。接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養瓊脂培養基上；至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30~35℃，培養18~24小時；接種白色念株菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基上25~28℃，培養24~48小時，上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為50~100CFU的菌懸液，備用。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，23~28℃，培養5~7天，加入3-5ml0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液（用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能通過濾菌絲的無菌巴氏吸管）至無菌試管內，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數50～100cfu的孢子懸液。菌液制備后在室溫2h內使用，在2~8℃可再24h內使用。b．適用性檢查：接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌各50-100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾入營養瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備3個平皿，混勻，凝固，置30~35℃培養48h，計數；取白色念珠菌、黑曲霉各50-100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備3個平皿，混勻，凝固，置23~28℃培養72h，計數。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。結果判定：若被檢培養基上得菌落平均數不小于對照培養基上得菌落平均數的70%，且菌落形態大小與對照培養基上得菌落一致，判改培養基的適用性檢查符合規定。4.2.2驗證方法驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗，并分別計算個試驗菌每次試驗的回收率。a．平皿法計數時，取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml和50～100cfu試驗菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。薄膜過率法計數時，取規定量試驗可能用的最低稀釋劑供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗菌，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數。b．菌液組

測定所加的試驗菌數。

c．供試品對照組取規定量的供試液，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。

d．稀釋劑對照組

若供試液制備需要分散、乳化，中和、離心或薄膜過濾等待處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液替代供試驗品，加入試驗菌，使最終菌濃度為每1ml供試液含50～100cfu，按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。

表1微生物驗證方法組數加樣加樣量（mL）回收率（%）是否合格試驗組供試液+菌液1菌液組菌液供試品對照組供試液稀釋劑對照組稀釋液+菌液e．結果判斷

在3次獨立的平行試驗中。稀釋劑對照組的平均菌落數稀釋劑對照的菌回收率= ×100%菌液組的平均菌落數試驗組平均菌落數—供試品對照組平均菌落數時間陰性對照結論金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌菌種類型培養基培養條件溫度銅綠假單胞白色念珠菌黑曲霉檢驗人復核人日期備注：2：培養基適用性