乙肝表面抗原及乙肝兩對半檢測主要內容檢測方法及原理膠體金免疫層析法

酶免疫技術免疫定量分析法結果判斷及臨床意義注意事項檢測的方法及原理檢測方法及原理膠體金免疫層析法Part1膠體金免疫層析法

將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結合墊上的膠體金標記試劑后相互反應，再移動至固定的抗原或抗體的區域時待檢物與金標試劑的結合物又與之發生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結果。檢測方法及原理膠體金免疫層析法Part2酶免疫技術

以酶標記的抗體（或抗原）作為主要試劑，將抗原抗體的特異性和酶高效催化反應的專一性相結合的一種免疫檢測技術。酶結合物既保留抗體（或抗原）的免疫學活性，又保留酶對底物的催化活性。特點：靈敏度高、特異性強、準確性好、試劑穩定、方法簡便易行檢測方法及原理Part2兩對半ELISA檢測原理

ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即:用于檢測抗體的間接法、用于檢測抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。檢測方法及原理Part2兩對半ELISA檢測原理

1

HBsAg：雙抗體夾心法——正比

單克隆HBsAb－HBsAg－多克隆HBsAb－HRP

2

HBsAb：雙抗原夾心法

——正比

HBsAg－HBsAb－HBsAg－HRP檢測原理Part2兩對半ELISA檢測原理3HBeAg：雙抗體夾心法

——正比

單克隆HBeAb－HBeAg－多克隆HBeAb－HRP4HBeAb：競爭抑制法

——反比

多克隆HBeAb－HBeAg－HBeAb－HRP/HBeAb（標本）5HBcAb：競爭抑制法

——反比

HBcAg－HBcAb－HRP/HBcAb（標本）檢測方法及原理Part3免疫定量分析方法

近年來，隨著抗病毒藥物的不斷問世，以及抗病毒藥物療效與乙肝病毒及其血清標志物水平之間關系的相關研究不斷深入，單純HBsAg定性檢測在療效的監測，特別是根據其早期變化對遠期療效進行預測方面，顯得越來越難以滿足要求。而且，很多學者對一些新藥上市注冊臨床試驗結果進行分析發現，HBsAg的定量檢測在抗病毒治療療效的監測方面確有非常重要的意義。因此，HBsAg的定量檢測就顯得十分重要。檢測方法及原理Part3免疫定量分析方法

要想完成HBsAg定量檢測，必須滿足以下條件：①采用自動分析系統，②有可溯源的標準品，③測定結果與標準品之間有線性關系。檢測方法及原理Part3免疫定量分析方法

化學發光技術是近二十年來發展非常迅速的非放射性免疫分析技術。

化學發光免疫測定（ChemiluminesentImmunoassay，CLIA）是免疫測定技術繼酶免技術（EIA）、放免技術（RIA）、熒光免疫技術（FIA）之后發展的一項新興測定技術。由于這種測定具備很高的特異性和很小的干擾，因此，如同RIA、FIA等一樣利用免疫反應的特異性和化學發光本身的信號特異性形成了目前所說的化學發光免疫測定（CLIA）技術。檢測方法及原理Part3免疫定量分析方法

原理：化學發光免疫分析儀是通過檢測患者血清從而對人體進行免疫分析的醫學檢驗儀器。將定量的患者血清和辣根過氧化物（HRP）加入到固相包被有抗體的白色不透明微孔板中，血清中的待測分子與辣根過氧化物酶的結合物和固相載體上的抗體特異性結合。分離洗滌未反應的游離成分。然后，加入魯米諾Luminol發光底液，利用化學反應釋放的自由能激發中間體，從基態回到激發態，能量以光子的形式釋放。此時，將微孔板置入分析儀內，通過儀器內部的三維傳動系統，依次由光子計數器讀出各孔的光子數。樣品中的待測分子濃度根據標準品建立的數學模型進行定量分析。最后，打印數據報告，以輔助臨床診斷。方法步驟

實驗步驟備注：因各廠家生產試劑操作方法不同，故參見試劑盒說明書結果判斷及臨床意義一、結果判斷結果判斷Part1膠體金免疫層析法結果判斷

以艾康生物檢測試劑盒為例：陽性（+）：兩條紅色條帶出現，一條位于測試區（T）內，另一條位于質控區（C）。陽性結果表明：標本中含有待測物質。陰性（-）：僅質控區（C）出現一條紅色條帶，在測試區（T）內無紅色條帶出現。陰性結果表明：標本中檢測不出待測物質。無效：質控區（C）未出現紅色條帶，表明不正確的操作過程或試紙條已變質損壞。在任何情況下，應重新測試。如果問題仍然存在，應立即停止使用此批號產品，并與當地供應商聯系。注意：測試區（T）內的紅色條帶可顯現出顏色深淺的現象。但是，在規定的觀察時間內，不論該色帶顏色深淺，即使只有非常弱的色帶也應判為陽性結果。結果判斷Part1膠體金免疫層析法結果判斷陽性（+）：僅質控區（C）出現一條紅色條帶，在測試區（T）內無紅色條帶出現。陽性結果表明：標本中含有待測抗體。弱陽性（+）：質控區（C）出現一條紅色條帶，在測試區（T）內有非常弱的紅色條帶出現。弱陽性結果表明：標本中含有少量待測抗體。陰性（-）：兩條紅色條帶出現，一條位于測試區（T）內，另一條位于質控區（C）。陰性結果表明：標本中檢測不出待測抗體。無效：質控區（C）未出現紅色條帶，表明不正確的操作過程或試紙條已變質損壞。在任何情況下，應重新測試。如果問題仍然存在，應立即停止使用此批號產品，并與當地供應商聯系。結果判斷Part2酶免疫技術

以上?？迫A試劑盒為例：1HBsAg：COV=陰性對照平均OD值+0.1樣本OD值/COV值≥1.0為陽性樣本OD值/COV值＜1.0為陰性2HBsAb、HBeAg：COV=陰性對照平均OD值×2.1（OD＜0.05按0.05計算）當樣本OD值≥COV值為陽性當樣本OD值＜COV值為陰性結果判斷Part2酶免疫技術

3

HBeAb：COV＝（陰性對照平均OD值＋陽性對照平均OD值）×0.5

標本OD值≥COV為陰性，＜COV為陽性4HBcAb：原倍血清COV＝陰性對照平均OD值×0.31:30稀釋血清COV＝陰性對照平均OD值×0.5

標本OD值≥COV為陰性，＜COV為陽性二、臨床意義臨床意義

臨床意義

臨床意義

HBsAg的定量檢測是目前監測和預測抗乙肝病毒治療后應答的新工具，結合HBVDNA及乙肝病毒e抗原（HBeAg）的陰轉和血清轉換，我們能更準確地預測患者的近期和遠期抗病毒治療的療效。因此，該檢測已在臨床上得以廣泛開展，特別是被用于判定抗病毒治療療效，以及根據早期下降的速度和幅度來預測遠期療效及決定療程上。臨床意義

聚乙二醇干擾素（PegIFN）α-2a治療乙肝患者的研究結果顯示，治療12周時HBsAg定量<1500IU/ml的患者（約占治療人群的32%），治療結束停藥1年時HBeAg血清轉換率可高達51%（66/129例），治療12周時HBsAg定量處于1500~20000IU/ml的患者（約占治療人群的52%），停藥1年時的HBeAg血清轉換率也能達到32%（53/166例），與之相反，如果治療12周后患者的HBsAg定量仍>20000IU/ml（約占治療人群的16%）,則治療結束停藥1年時的HBeAg血清轉換率僅為19%（8/43例）。

臨床意義

此外，研究還發現，患者治療后HBsAg下降速度和幅度還與其長期清除率有關。在治療24周HBsAg<1500IU/ml且同時出現HBeAg血清轉換的患者中，有20%可獲得HBsAg清除。因此，HBsAg定量可以用于指導治療。而且，治療結束時HBsAg水平越低，停藥后隨訪的HBsAg清除率越高。臨床意義

布魯內托（Brunetto）研究顯示，無論是HBeAg（+）還是HBeAg（-）的慢性乙肝患者，在接受干擾素治療48周后，若其HBsAg定量<10IU/ml（占12%，23/194例），則停藥隨訪3年的HBsAg消失率可達52%（12/23例）；與之相反，如果HBsAg定量結果>10IU/ml（占88%，171/194例），隨訪3年，僅有2%（4/174例）的患者出現HBsAg消失。同樣，治療48周時HBsAg下降>2log的患者，隨訪3年，HBsAg消失率高達42%；下降<2log患者中，僅有3%的HBsAg消失。因此，在治療結束時，對于那些HBVDNA陰轉并出現HBeAg血清轉換的患者，如果HBsAg水平下降不明顯，可考慮延長療程，以進一步提高HBeAg血清轉換率和HBsAg清除率。臨床意義檢測模式分析Part4檢測結果模式分析HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAbPreS1AgPreS1Ab簡要意義乙肝表面抗原乙肝表面抗體乙肝E抗原乙肝E抗體乙肝核心抗體乙肝前S1抗原乙肝前S1抗體HBsAg陽性提示乙肝攜帶；HBeAg、pre-S1Ag、陽性提示病毒復制,傳染性強；HBsAb、HBeAb陽性提示機體具備免疫力，趨于恢復，pre-S1Ab陽性提示肝細胞有阻斷乙肝病毒感染的功能。-------沒有乙肝病毒感染，不具備免疫力。-+-----接種疫苗，乙肝恢復，具備免疫力。------+急性乙肝恢復或接種進口疫苗，具備免疫力。-+----+接種疫苗或少量乙肝病毒感染后恢復，免疫力強。+------表面抗原攜帶；急性乙肝病毒感染潛伏期后期。+-+--+-急性乙肝早期，病毒復制，有傳染性。+-+-++-急慢性乙肝，病毒復制，有傳染性（即大三陽）。+-+-+-+急慢性乙肝，恢復期或治療有效，有傳染性。+---+--急慢性乙肝，傳染性弱或沒有傳染性。臨床意義HBsAgHBsAbHBeAgHBeAbHBcAbPreS1AgPreS1Ab簡要意義乙肝表面抗原乙肝表面抗體乙肝E抗原乙肝E抗體乙肝核心抗體乙肝前S1抗原乙肝前S1抗體HBsAg陽性提示乙肝攜帶；HBeAg、pre-S1Ag、陽性提示病毒復制,傳染性強；HBsAb、HBeAb陽性提示機體具備免疫力，趨于恢復，pre-S1Ab陽性提示肝細胞有阻斷乙肝病毒感染的功能。+---++-急慢性乙肝，病毒復制有傳染性，乙肝E抗原變異。+--++--急慢性乙肝，沒有傳染性或傳染性弱（即小三陽）。+--++-+急慢性乙肝或乙肝治療后恢復期，傳染性弱。+--+++-急慢性乙肝，病毒復制有傳染性，乙肝E抗原變異。----+--乙肝核心抗隱性攜帶，有乙肝既往有感染史。---++--急性乙肝恢復期或既往有感染史。-+-++-+乙肝恢復期或急性乙肝既往有輕度乙肝病毒感染史。+--+---慢乙肝病毒感染攜帶，傳染性弱或沒有傳染性。+-++++-急性乙肝趨于恢復，乙肝攜帶，病毒復制有傳染性。-----+-提示乙肝病毒早期感染，有傳染性，建意檢測HBV-DNA。臨床意義

一、何謂PreS1Ag？

PreS1Ag是乙型肝炎病毒基因組前S1區編碼的前蛋白，具有很強的免疫原性，是病毒表面抗原(HBsAg)的組成成分。它只存在于具有傳染性的完整的乙肝病毒顆粒上，是黏附和侵襲人體肝細胞的主要因子。

臨床意義

二、檢測PreS1Ag的意義

1.PreS1Ag的檢測能夠彌補乙肝五項檢測的不足

①PreS1Ag出現在急性乙肝感染的最早期，在轉氨酶升高前，即可查出，是早期診斷乙肝病毒感染的標志。

②急性乙肝PreS1Ag轉陰越早，預后越好，提示病毒清除和病情好轉。反之，PreS1Ag持續陽性，則提示將發展成慢性肝炎。

③抗HBe(＋)慢性乙肝約占慢肝的30%—50%，檢測PreS1Ag(＋)，提示病毒在機體內繼續復制，具有傳染性，患者容易演變為肝硬化或肝癌。加查PreS1Ag，彌補了因HBeAg的缺失造成的診治困難。

④在乙肝無癥狀攜帶者中，有一定比例HBeAb(＋)者，如果PreS1Ag(＋)可反映出病毒并沒有被清除，在體內復制仍然活躍，肝臟存在潛在的病理損傷。

⑤抗病毒治療，檢測PreS1Ag可作為治療前的患者篩查(適應癥)和治療后的療效判斷。

臨床意義

2.PreS1Ag檢測能夠加強HBV—DNA檢測的作用

①因病毒基因變異的影響，個別病毒變異株感染的患者HBV—DNA檢測為陰性，PreS1Ag的檢測可以防止漏檢，并提示可能存在病毒變異跡象。

②PreS1Ag是免疫測定技術，具有快速、直接、簡便的特點。PreS1Ag的檢測與HBV—DNA檢測在乙肝的診斷方面相互補充和加強，就像HBV—DNA不能替代乙肝五項的檢測一樣，同樣HBV—DNA不能替代PreS1Ag的檢測。臨床意義

三、何謂PreS1Ab？

是HBV的中和抗體，能阻止HBV侵入肝細胞，抗-PreS1Ab在急性期和恢復早期出現，預示病毒正在或已被清除，疾病預后良好。乙型肝炎病毒前S1抗體可作為急性乙型肝炎臨床預后早期診斷的血清學指標。臨床意義

四、PreS1Ab意義：

1．前S1抗體是急性HBV感染最早期出現的抗體比HBsAb和抗HBcIgM出現早，起到了臨床預后早期診斷的作用。前S1抗體出現提示預后良好。前S1抗體參與病毒的清除，前S1抗原/抗體的反轉預示疾病將進入恢復期，急性乙型肝炎患者前S1抗原陰轉越早，前S1抗體陽轉越早預后越好。

2．對慢性乙型肝炎患者長期動態、隨訪出現血清前S1抗體陽性者，HBVDNA陰轉率顯著增高或HBVDNA含量顯著下降，預示疾病恢復良好。

3．乙型肝炎病毒前S1抗體可作為臨床抗病毒療效疾病預后的血清學指標。

4．總之，乙型肝炎患者前S1抗體出現與否，與病程的進展以及預后有較密切的關聯。前S1抗體的檢測對乙肝的診斷及治療有較為重要的臨床意義。三、注意事項注意事項

1標本采集與處理的影響標本收集后應盡快分離出血清或血漿以避免溶血。檢測時應盡量使用新鮮的標本。標本若不能及時送檢，可在2℃-8℃冷藏3天。長期保存需冷凍于-20℃，忌反復凍融。標本嚴重溶血及混有紅細胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內不易洗凈，殘留在孔內的血紅蛋白具有過氧化物酶樣的活性，催化底物顯色造成假陽性。標本凝固不全，正常血液采集后1/2-2h開始凝固，18-24h血塊完全收縮。在工作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果；因此血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當的促凝劑。注意事項

2試劑影響因各廠家對檢測標本要求、操作步驟不同，故認真閱讀檢測試劑說明書能避免不必要的實驗誤差（特別是膠體金免疫法）。不同廠家生產的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為89.4%-99.3%、78-89%,存在較大差異。有的廠家酶標板孔間A值差大于15%；標記酶的活性及顯色液的穩定比較差。使用質劣的試劑必然導致結果的假陽性或假陰性。因此選擇高質量的試劑是保證結果準確的關鍵之一不同方法學的檢測試劑，會使兩對半結果出現一些不同。例如：在實際工作中常用ELISA檢測HBsAg結果為陰性，而電化學發光檢測為陽性。除方法學的靈敏度外；還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的差別。單抗對變異抗原或亞型乙肝標志物檢測存在差異。注意事項

3干擾物質的影響大約40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質，可以不同程度影響檢測結果；常見的干擾物質有：類風濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫源性