第15章流式細胞技術的原理和應用陳鯉翔副教授Email：lxchen@流式細胞技術（Flowcytometry,FCM)

是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速對單個細胞或其他生物微粒（如細菌）的理化特性進行多參數定量分析和分選的技術。流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選基礎上發展起來的對細胞的物理或化學性質（如大小、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等）進行快速測量并可分類收集的高技術。30年代：設想使細胞檢測自動化50-60年代：分層鞘流原理、分光光度計定量細胞成分及結合測量值對細胞分類，提出細胞分選70年代：單克隆抗體技術和熒光標記技術1973年：第一臺商用流式細胞儀FACSI發展方向：熒光染料的開發、細胞的制備方法、提高電子信號的處理能力等流式細胞儀的發展史BD公司流式細胞儀FACSCaliburLSRIIFACSCantoFACSCountFACSVantageFACSAriaMoFloAstriosEQ超高速流式分選系統Gallios流式細胞儀Beckman公司流式細胞儀Navios流式細胞分析系統測量速度快，最快可在1秒鐘內計測數萬個細胞；可進行多參數測量，可以對同一個細胞做有關物理（如大小、內部結構）、化學特性（如DNA、RNA）的多參數測量，并具有明顯的統計學意義；是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術、計算機技術、顯微熒光光度技術、分子生物學技術、免疫學技術、流體力學、細胞化學、圖像技術等眾多領域的知識和成果；既是細胞分析技術，又是精確的分選技術。細胞不被破壞，測量快速、大量、準確、靈敏、定量流式細胞術的特點應用：細胞生物學，腫瘤學，血液學，免疫學，藥理學，遺傳學及臨床檢驗學等細胞組成細胞功能大小細胞表面/胞漿/核--特異性抗原粒度細胞活性DNA,RNA含量胞內細胞因子蛋白質含量激素結合位點鈣離子,PH值,膜電位酶活性流式細胞儀常檢測的細胞特性液流系統光學系統數據處理系統一、流式細胞技術原理1、流式細胞儀的基本結構：由樣本和鞘液組成待測細胞 單個細胞的懸液 熒光染料標記的單抗對其染色受清潔氣體壓力 從樣品管進入流動室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。

（1）液流系統FluorescenceSignalFocusedLaserBeamShealthFluid液流系統示意圖InjectorTip樣本管鞘液管激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長/短波長，通過短/長波長光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內光濾片：長通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（熒光）（2）光學系統光學系統示意圖散射光的測定

細胞在液柱中與激光束相交時向周圍360°立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內顆粒折射等有關，主要分為前向散射光和側向散射光。光信號的測定

前向散射光（forwardscatter,FS）：激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度(0.5°~10°)向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。

側向散射光（sidescatter,SS）：激光束照射細胞時，光以90°角散射的訊號，用于檢測細胞內部結構屬性。 測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進行分析或分選。此為血細胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細胞單核細胞中性粒細胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發后產生，發射的熒光波長與激發光波長不同。每種熒光染料會產生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。線性放大器和對數放大器熒光測定熒光補償FITCAPCPEPerCP/Cy5.5每一種熒光分子都發射某一特定波長范圍內的光，然而這些熒光的發射光譜會發生重疊，有時這種重疊現象非常顯著。熒光補償是指修正熒光滲漏的過程，如從探測器除去除匹配熒光以外的任何熒光信號。熒光補償PEFITCPE+cellsFITC+cellsTodocolourcompensation:ForPureFITC+cells,=PEsignal-%FITCsignalForPurePE+cells,=FITCsignal-%PEsignalAftercompensationPEFITCPE+cellsFITC+cellsGOODcompensation:Y-meanoftheFITCcell=theY-meanof-/-cellsX-meanofthePEcell=theX-meanof-/-cellsPEFITCPE+cellsFITC+cellsOVERcompensation細胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細胞的液滴棄去偏轉落入收集器壓電晶體產生機械振動不充電充電細胞分選分選速度：單位時間內分選的細胞數量。與懸液中細胞的含量成正比。分選純度：分選出的目的細胞占所有收獲細胞的百分率。分選收獲率：實際收獲的分選細胞與設定通過測量點的分選細胞之間的比率。與純度成反比。分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，再經分選后得到目的細胞的實際得率。與分選速度成反比。分選的技術要求（3）數據處理系統FS：反映顆粒的大小SS：反映顆粒的內部結構復雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數量多少參數單參數直方圖雙參數點圖、二維等高圖三參數直方圖多參數分析數據顯示方式由一維參數(散射光或熒光)與顆粒計數(COUNT)構成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。單參數直方圖雙參數點圖雙參數直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數，根據這兩個參數就可以確定細胞在圖上的表達位置。雙參數信號通常采用對數信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數量的多少。

用等高線來表示細胞數，在一條等高線上細胞數相同，不同的等高線上細胞數不同。二維等高圖三參數直方圖

三維坐標勻為參數（散射光或熒光）而非細胞數。多參數分析：當細胞標記了多色熒光，被激發光激發后，得到的熒光信號和散射光信號可根據需要進行組合分析。一般利用所得參數的兩兩組合并利用設門（Gate)技術，來分析參數之間的相互關系。多參數分析Gate設置：指在某一張選定參數的直方圖上，根據該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數組合的直方圖只體現這群細胞的分布情況。根據門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。門（Gate）設置A淋巴細胞B單核細胞C中性粒細胞A、B、C均為任意門區閾（region,R）與門(gate,G)是兩個相關的概念，區閾可與門對應，但是也可以包含于門。Region設置D1CD4+/CD3-D2CD4+/CD3+D3CD4-/CD3-D4CD4-/CD3+如十字門分析時，就可以由四個區域構成，即G=D1+D2+D3+D4。樣本制備：單細胞懸液標記染色：光譜不重疊陰性對照的設置：檢測標本的重復性質量控制二、流式細胞儀免疫分析的技術要求

外周血淋巴細胞樣品的制備：淋巴細胞分離液分離外周血中單個核細胞。Ficoll，40kd，高密度，低滲透壓，無毒性。（比重為1.0177±0.001的分層液)樣本制備

利用紅細胞裂解液去除紅細胞后，得到外周血中所有白細胞的流式細胞分析的二維散色光點圖。培養細胞的樣品制備：單層培養細胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使細胞從培養皿上消化下來，然后離心漂洗。懸浮培養細胞，可不用酶消化，直接吹打制備成單細胞懸液。新鮮實體組織單細胞懸液的制備機械法：剪碎法、網搓法、研磨法。酶處理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等?；瘜W試劑處理法：EDTA、EGTA等。表面活性劑處理法：Triton-x100、皂素等。防止細胞自溶，保持細胞膜原有的特性保存的方法：1、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。2、乙醇與甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。3、甲醛或多聚甲醛固定法：細胞不具有生物活性，但細胞表面熒光染色分析不受影響。單細胞懸液的保存適用條件:有較高的量子產額和消光系數對488nm的激發光波長有較強的吸收發射光波長與激發光波長間有較大的波長差易與標記單抗結合而不影響抗體的特異性常用的熒光染料與標記染色FITCTexasredPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細胞懸液異硫氰酸熒光素得州紅能量傳遞復合染料藻膽蛋白類幾種常見的熒光染料名稱染料激發波長熒光顏色溶解性對PH敏感性特點異硫氰酸熒光素FITC488綠525易敏感易溶于水，與抗體結合不影響特異性得州紅Texasred568紅615不易不敏感穩定，偶聯后量子產額低藻紅蛋白PE488橙575易不敏感具較多發光基團，消光系數和量子產額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅670能量傳遞復合染料PEcy5488紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料 用化學法將兩種不同激發波長的染料結合在一起，在488nm激發光照射下，通過一個熒光染料被激發后產生的發射波長再激發另一熒光染料產生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信號。能量傳遞復合染料Laser488nmPECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復合染料機制熒光染料與細胞成分的四種結合方式 結構親和式 嵌入結合 共價鍵結合 熒光標記抗體特異性結合免疫熒光標記方法 直標:干擾少,但需購買多種單抗 間標:步驟多,干擾多,不需標記多種抗體 組合標記：免疫熒光標記FITC+PE488525、575綠色、橙色FITC+Tred488525綠色

568615紅色FITC+PeCy5488525、675綠色、紅色FITC+ECD488525、625綠色、橙紅色F+P+PeCy5488525、575、675綠、橙、紅色F+ECD+PeCy5488525、575、675綠、橙紅色、紅色F+P+APC488525、575綠色、橙色

633670紅色熒光染料激發波長（nm)發射波長（nm)顏色雙或多參數熒光抗體的組合標記適當的制備方式處理紅細胞實體組織來源標本用機械法溫度25-37℃，PH7.0-7.2質量控制單細胞懸液制備的質控免疫熒光染色的質控溫度PH染料濃度固定劑光路與流路校正:確保激光光路與樣品流處于正交狀態，減少變異（CV）。PMT（光電倍增管）校準:保證樣品檢測時儀器處于最佳靈敏度工作狀態。絕對計數校準:保證計數的準確性。Flow-checkFlow-setFlow-count儀器操作的質控同型對照：即免疫熒光標記中的陰性對照，選用相同源性的未標記單抗作為對照調整和設置電壓，以保證特異性。全程質量控制：在流式檢測中，樣品標記、溶血、洗滌、儀器質量控制和上機檢測的過程都會直接影響檢測結果。采用標準質控樣品來進行全程質控，使得同類實驗室建立質控比對，數據可以互用。免疫檢測的質控三、流式細胞技術應用以細胞免疫功能測定為例淋巴細胞亞群活化的T淋巴細胞抗原特異性免疫細胞調控性T細胞樹突狀細胞先天免疫細胞淋巴細胞亞群T淋巴細胞(CD3+)名稱功能CD3+CD4+輔助性/誘導性T細胞(Th/Ti)輔助和誘導細胞免疫和體液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-輔助性T細胞(Th)誘導性T細胞(Ti)輔助細胞免疫和體液免疫誘導細胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細胞(Ts/Tc)抑制免疫反應/殺傷異源細胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T細胞(Ts)殺傷性T細胞(Tc)抑制細胞和體液免疫細胞毒性T細胞CD3+CD4+CD8+活化的T細胞在T細胞惡性增生時升高

CD3+CD4-CD8-有調節功能的T細胞,其表達

/T細胞受體(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/靜止的T淋巴細胞

當免疫系統沒有能力更新輔助性或抑制性/細胞毒性淋巴細胞的祖細胞時此細胞亞群較低

CD45RA-CD45RO+記憶性T淋巴細胞

病菌感染時升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T細胞,感染時升高

感染時升高淋巴細胞亞群活化T淋巴細胞名稱功能CD3+HLA-DR+活化T細胞CD4+HLA-DR+活化的輔助性/誘導性T細胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細胞CD4+CD25+活化的輔助性/誘導性T細胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味著HIV患者的預后較差B淋巴細胞(19+)CD19+CD23+活化的B細胞過敏患者中升高