四、色譜柱

色譜分析是一種先分離后檢測的分析方法。分離過程是由色譜柱來完成的。一個特定分離的成敗，在很大程度上取決于色譜柱的選擇。因此，色譜柱是氣相色譜的心臟。

(一)色譜柱的幾種類型氣—固填充柱、氣—液填充柱、毛細管柱以及填充毛細管柱等。

氣-液填充色譜柱是在柱管中裝填著表面涂有一薄層高沸點有機物液膜的惰性固體作為固定相，高沸點有機化合物是固定液，而惰性固體是載體。

(二)柱管材料與形狀1．柱管材料

選擇柱管材料的主要依據之一是柱管壁表面的特性。常用玻璃柱和不銹鋼柱。2．柱管形狀

柱的形狀并無一定特殊要求，常用形狀有U形和螺旋形兩種。實踐證明，只要填充的均勻緊密，柱形狀對柱效沒有顯著的影響。3．柱的內徑和長度

填充柱的內徑一般為2—6mm，常用4mm。柱內徑細，柱效高，為了提高柱的裝填量，最好采用細顆粒度的載體。柱長從0.5m一6.0m均可選用，具體柱長一般由分離任務的要求而定。在可能的情況下，色譜柱短比色譜柱長好．這樣可以提高分析速度。

(三)固定液

涂于色譜柱(空心柱除外)填充物表層的液膜狀物質即固定液。它在氣相色譜分析中對各組分的分離起著決定性的作用。1．對固定液的要求

用氣相色譜分析農藥時，柱溫一般在150一250℃左右，且化合物組分、試樣類型、干擾物質等情況較為復雜，故對固定液要求為：

(1)在操作溫度下蒸氣壓低，熱穩定性好，與被分析物質或載氣不產生不可逆反應。由蒸氣壓和熱穩定性的情況決定固定液的最高使用溫度。

(2)在操作溫度下呈液態，而且粘度越低越好。物質在高粘度的固定液中傳質速率慢，因而柱效率降低。這個要求決定了固定液的最低使用溫度。

(3)選擇性高，即對兩個沸點相同或相近的不同類型的組分，要有盡可能高的分離能力。

(4)對樣品組分有足夠的溶解能力。2．固定液的分類

色譜固定液已約有千種之多，分類方法主要是根據固定液的分子結構、極性和保留指數，把固定液按三種方法分類：①按固定液的化學結構和所含官能團；②按固定液相對極性；③按形成氫鍵能力的強弱。因按①分類，簡單、實用，便于根據樣品和固定液的“相似相溶原理“選擇固定液．故此種分類法在實際工作中，對農藥分析參考價值較大，現介紹如下：

按固定液的化學結構和所含官能團分類，可把固定液分為10類。僅重點介紹農藥分析中常用的兩類。

(1)烴類：包括烷烴、芳烴和其聚合物，是非極性或弱極性固定液。其中角鯊烷是典型的非極性固定液，通常把其相對極性定為零，有標準非極性固定液之稱。此外，還有石蠟油、真空脂、聚乙烯等。

(2)硅酮類：該類是目前使用最為廣泛的固定液。其主要優點為：

①溫度粘度系數小，柱溫對柱效影響不大，使用溫度范圍寬。

②蒸氣壓低，熱穩定性好，固定液流失少。

③對大多數有機物都有很好的溶解能力，有通用型固定液之稱。

④硅原子上可以引入多種官能團，使其成為具有不同極性的固定液，大大擴大了應用范圍。3．固定液的選擇

試樣分離得好壞，以及分析水平的高低往往取決于固定液也即是色譜柱選擇恰當與否。在農藥分析中，多用“相似相溶”原理和“以實驗方法”選擇固定液。

“相似相溶”原理：“相似相溶”原理是根據被分離組分與固定液之間有某些相似性，如官能團、極性、化學性質相似，則組分在固定液上的溶解度大，分配系數就大，選擇性就好；反之，溶解度小，分配系數小，選擇性就差。

（四）擔體

擔體是承擔固定液的固體材料。擔體又稱載體。把固定液涂漬在擔體表面上，形成均勻薄膜，就構成氣液色譜柱的填充物。擔體顆拉直徑、擔體顆粒均勻度、擔體表面積的大小均為影響柱效的因素。擔體表面的物理化學性質，擔體的物理結構是影響色譜柱峰形拖尾的主要原因。

1．對擔體的要求

(1)比表面積大：即指單位重量的擔體具有較大的表面積，一般指每克擔體具有若干平方米表面積。比表面積大，它的柱效就高；

(2)表面對溶質無吸附或吸附性很弱；

(3)熱穩定性好；

(4)化學惰性：即與固定液或被分析組分不起任何化學反應；

(5)顆粒大小盡可能均勻；

(6)具有足夠的機械強度。2．擔體種類

色譜擔體大致可分為兩大類：目前硅藻土型擔體，在氣—液色譜中普遍大量使用，農藥分析中用非硅藻土型擔體甚少。硅藻土擔體很多，商品有百余種。國內生產的硅藻土擔體有十幾種。國內外常用擔體見表4—5、6。

二甲基二氯硅烷(DMCS)六甲基二硅胺(HMDS)3．擔體表面的活性

色譜峰的拖尾現象，是色譜分析中經常遇到的問題。這種現象既影響柱效，又影響保留值的測量與峰面積的計算，所以解決峰形拖尾問題，一直是色譜分析中必須研究的重要課題之一。

擔體表面的活性是造成色譜峰形成拖尾的主要原因。理想的擔體表面無論對組分或固定液都是完全惰性的。除了特氟隆擔體之外，對經常使用的硅藻土擔體來說，由于表面存在相當數量的硅醚基團(—Si—O—Si—)和硅醇基團(—Si—OH)，存在雜原子基團，如＞Al—O—，＞Fe—O—等基團，擔體偏酸性或偏堿性，以及晶格不均勻性，因而表面既有催化活性作用點，又有吸附活性作用點。

(1)形成氫鍵的活性作用點：無論哪一種硅藻土擔體，其表面都存在硅醇基(硅羥基)，若被分離的組分為醇、醛、酮、酯等，能造成峰形的拖尾。

(2)酸性活性作用點：這系指表面上的酸性氧化物雜質，分離堿性胺類化合物時能引起峰形拖尾。

(3)堿性活性作用點：這系指表面上堿性氧化物雜質，能引起酸性化合物、脂肪族和芳香族羧酸酚類等峰形拖尾。

由于擔體表面活性作用點的存在，它與組分之間發生的不是溶解分配作用，而是吸附作用(不可逆吸附現象)。它的分配等溫線是非線性的，它的峰形是拖尾的。

擔體表面的活性是造成色譜峰拖尾的主要原因。而表面活性則是由形成氫鍵的活性作用點、酸性活性作用點和堿性活性作用點等所引起，故為了改善峰形，擔體需經去活性處理。

4．擔體表面的去活性處理

吸附活性作用點，不僅存在于擔體表面上，還存在于金屬或玻璃色譜柱的管壁以及其它聯結管路的管壁上。

消除擔體表面活性的方法，大致有以下幾種：

(1)酸洗法采用鹽酸法、冰醋酸法、硝酸法、硫酸法和磷酸法處理擔體能除去擔體表面上大部分A1、Fe、Ca、Mg的雜質，從而使表面活性顯著下降。通常酸洗方法系用濃鹽破浸漬擔體幾個小時后，濾去鹽酸，水洗至呈中性，然后用甲醇或乙醇漂洗，烘干，備用。酸洗除去鐵和鋁雜原子，可防止它們引起的催化作用。這對于分析天然產物如甾類、萜烯類以及亞硝基化合物很有意義。

(2)堿洗法

一般用5％KOH—甲醇溶液浸泡，再用水沖至呈中性，烘干備用。堿洗目的是除去表面的Al2O3等酸性作用點。(3)硅烷化法

硅烷化法是改變擔體表面硅醇基團的有效方法。用硅烷化試劑和擔體表面的硅醇基團起反應，可以除去表面的氫鍵結合能力，從而可以改進擔體的性能。(五)色譜柱的制備要制備一根分離效能較高的色譜柱，必須在擔體上涂上一層薄而均勻的液膜，再把涂好的固定相均勻而緊密地裝填到色譜柱管內。因此，固定液的涂漬和色譜柱的裝填是色譜分析重要操作技術之一。這里主要介紹填充柱。

1．色譜柱管的試漏和清洗由于存放、運輸等過程可能使色譜柱管沾污或損壞，使用前應將色譜柱進行試漏與清洗。

試漏試漏的操作方法很簡單，只要將柱管全部浸入水中，將其出口堵死，人口通人氮氣(N2)在高于使用的操作壓力下，以管壁沒有氣泡冒出為合格。

清洗

(1)玻璃柱管可注入洗液浸泡兩次，然后用自來水沖至中性，再用蒸餾水清洗，烘干后備用。

(2)不銹鋼柱管可用5％一10％的熱堿(NaOH或KOH)水溶液抽洗4—5次，以除去內壁的油污，然后用自來水沖至中性，再用蒸餾水清洗，烘干后備用。

(3)已經用過的色譜柱需要重換其固定相時，柱管也應當用相應的溶劑(如乙醚、乙醇、熱堿液)依次洗滌，自來水沖至中性，然后用蒸餾水清洗，以除去柱管中的擔體粉末及粘附在管壁上的固定液膜，烘干后備用。2．固定液的涂漬技術

幾種常用的涂漬方法：

(1)“常規”涂漬法：對配比大于5％以上(所謂配比，即固定液與擔體的重量比)的固定液，可用“常規”法涂漬。其方法是：將一定量的固定液放置在一蒸發皿中，加入適量的溶劑，待固定液溶解后，再加入定量的載體。在一般實驗室的條件下，固定液可借助溶劑作用涂敷在載體表面上。最后把涂漬上固定液的載體放在紅外燈下輕輕攪拌，烘干并趕走溶劑。一般要求，烘干后的固定相基本上不應有溶劑氣味，這樣才可裝入色譜柱老化后使用。

對于配比小于3％的固定液，由于固定液含量少，剛能鋪蓋其擔體表面時，如果涂漬不均勻，老化也不能完全解決，只能采用下述兩種方法涂漬：

(2)抽空盤涂法:

在蒸發皿或盤中，稱取一定量固定液，加入適量的溶劑，待其完全溶解后，再加入一定量的載體，將器皿置于真空干燥器中，接水泵抽空5min，然后取出放在通風柜中，讓溶劑自然蒸發或紅外燈下烘干，不要攪拌也不要過篩。

(3)抽空蒸發法：

將一定量的固定液置于圓底燒瓶中，加入適量溶劑，待完全溶解后加入一定量的擔體。用旋轉蒸發儀使溶劑蒸發至干，然后裝柱使用。3．色譜柱的填充

固定相填充的好壞，直接影響柱效能。通常采用泵抽填充法，即把色譜柱的尾端(注意，即接檢測器的那一端)塞上玻璃棉，再接真空泵，色譜柱的前端(即接氣化室的那一端)接上一個漏斗。在真空泵的抽吸下，不間斷地從漏斗中倒入要裝的固定相，并不斷輕輕敲打色譜柱管，直至固定相不再進入柱管為止。4．色譜柱的老化

裝填好的色譜柱要進行老化處理后，才能接至檢測器使用。

老化的目的：①為了徹底除去固定相中殘余溶劑和某些揮發性雜質，確保檢測器不受污染，使之有較低的本底電流。②進一步促使固定液均勻地、牢固地分布在載體表面上，可以提高柱效能。

老化的方法

把色譜柱接入載氣氣路系統(為安全起見，一股采用氮氣作為載氣，不可使用氫氣)，色譜柱的一端接在氣化室上；另一端放空(不要接在檢測器上，以免沾污)，用與操作時相近的載氣流速，略高于操作溫度10一20℃(僅要低于固定液的最高使用溫度)的條件下，通氣4—8h甚至24h。基本老化好后，再接上檢測器檢查。當記錄儀基線平直以后，老化過程才算結束。五、定性定量分析5.1氣譜操作條件的選擇

（1）色譜柱

色譜柱的選擇是整個分析工作中的中心工作。應針對試樣的性質與要求選擇柱長、柱材料、擔體、固定液及吸附劑等，其中以固定液的選擇為主。

（2）柱溫的選擇

大多數色譜柱是在等溫條件下操作的,柱溫的選擇直接影響分析時間。

程序升溫:

是在一個色譜分析周期里不斷改變色譜柱的溫度，使一些復雜混合物的分析能做到：1)提高分辨能力；2)峰形得到改善；3)縮短分析周期。

（3）氣化溫度

在保證試樣不分解的情況下，適當提高氣化溫度對分離及定量有利。一般選擇氣化溫度比柱溫高30一70℃。（4）流速的選擇

根據色譜動力學理論，流速有一個最佳值，此時柱的分離效率最高。對于大多數試樣來說，為了保證快速分析，經常選擇較高的流速，但當采用熱導檢測器時，為了檢測低含量的組分，有時采用低流速。通常流速選用范圍在50mL／min左右。（5）試樣用量的選擇

應根據試樣的狀況與分析的要求選擇試樣用量，對痕量分析或純度分析，為了顯示檢測器的信號，試樣用量要較大；為了有利于瞬間氣化，用量要減小。5.2樣品制備在氣相色譜分析中，樣品制備除應按一般化合物考慮外，尚需注意農藥制劑以下特殊要求：1．提取溶劑選用之提取溶劑，必須保證能把農藥有效成分從檢測對象中提取完全。2．稀釋溶劑選用乳劑、超低量油劑等稀釋所用之溶劑時，必須注意其要與有效成分能充分溶解，并且在氣譜上出峰快，返回基線快。3．溶劑的化學性質與規格溶劑的化學性質要穩定，不應因其與制劑中的成分反應而影響測定結果。4．提取方法可用浸泡、超聲波等多種方法，但不能加熱提取，以免農藥分解。(一)定性分析

用氣相色譜法進行定性分析，在農藥分析中，常利用雙柱或多柱、選擇性檢測器與化學方法相結合等方法進行定性分析或農藥確證。近年來氣譜與質譜、光譜等聯用，既充分利用了色譜的高效分離能力，又利用了質譜、光譜的高鑒別能力，再加電子計算機對數據的快速處理及檢索，為未知物的定性分析打開了一個廣闊的前景。1．根據色譜保留值進行定性分析

各種物質在一定的色譜條件(固定相、操作條件)下均有固定不變的保留值，因此保留值可作為一種定性指標．是最常用的色譜定性方法。但其可靠性不足以鑒定完全未知的物質。2．與其它方法結合的定性分析法

(1)與質譜、紅外光譜等儀器聯用：其中特別是氣相色譜和質譜的聯用．是目前解決復雜未知物定性問題的最有效工具之一。

(2)與化學方法配合進行定性分析：帶有某些官能團的化合物，經一些特殊試劑處理，發生物理變化或化學反應后，其色譜峰將會消失或提前或移后，比較處理前后色譜圖的差異，就可初步辨認試樣含有哪些官能團。3．利用檢測器的選擇性進行定性分析

利用不同檢測器具有不同的選擇性和靈敏度，可以對未知物大致分類定性。（二）定量分析

定量分析的根據是：被測組分的重量或該組分在載氣中的濃度與色譜圖上的峰面積或峰高成正比。

常用的定量方法為內標法、外標法。

制劑及原藥分析對準確度、精密度要求較高，故多用內標法殘留分析因檢測含量極微，故對準確度、精密度較制劑要求為低，多用操作簡單、計算方便的外標法。

(1)外標法

本方法系用配制已知濃度的標準樣進行色譜分析，以各組分的峰高或峰面積和與其相對應的濃度作標準曲線，然后在與標準試樣測定時同樣的操作條件分析試樣并與標準樣進行比較。根據試驗結果，從標準曲線中計算出試樣的濃度。工廠的日?？刂品终?，較多采用這種方法。

外標法的優點：操作簡單和計算方便，分析結果的準確性主要取決于進樣量的重復性和操作的穩定性。

外標法的缺點：若儀器和操作條件不穩定時，對結果影響很大。為此，需要用標準樣及時校正。

(2)內標法若測定樣品中某一組分或某幾個組分的含量，可以把一定量的某一種純物質，加入到樣品內作為內標物，然后進行色譜定量計算。方法的優點：定量結果比較準確，操作條件與進樣量對分析結果影響不大，亦適用于低含量的組分定量。

計算方法為：通過測出內標物的峰面積和欲測定組分的峰面積后，計算該組分的含量。六、色－質聯用分析(GC－MS)(一)概述