標準解讀

《GB/T 34776-2017 T4 DNA連接酶 酶活及雜質檢測方法》是一項國家標準，主要規定了T4 DNA連接酶活性測定以及雜質檢測的具體方法。該標準適用于T4 DNA連接酶的質量控制、科學研究和生產過程中對酶活性與純度的評價。

在酶活性測定方面，標準中描述了一種基于電泳的方法來評估T4 DNA連接酶將兩個DNA片段連接起來的能力。具體來說，通過使用已知序列的線性雙鏈DNA作為底物，在一定條件下讓T4 DNA連接酶作用于這些底物上，之后利用瓊脂糖凝膠電泳分離未連接的DNA片段與已經成功連接形成的環狀DNA分子。根據凝膠上不同形式DNA條帶的位置及其相對強度，可以計算出T4 DNA連接酶催化反應效率，從而間接反映出酶活性水平。

對于雜質檢測，則主要包括蛋白質雜質和其他非特異性核酸內切酶活性的檢測兩部分內容。前者可通過高效液相色譜法（HPLC）或SDS-PAGE等技術手段實現；后者則需設計特定實驗來驗證樣品中是否存在可能干擾目標酶功能的其他類型核酸酶。例如，可以通過觀察加入待測樣品后質粒DNA是否發生降解來判斷是否有非特異性核酸內切酶污染存在。

整個標準詳細列出了實驗所需材料、試劑配制方法、操作步驟、結果分析等內容，并給出了相應的質量控制指標要求。這為確保T4 DNA連接酶產品的質量和一致性提供了科學依據和技術支持。


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....

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  • 現行
  • 正在執行有效
  • 2017-11-01 頒布
  • 2018-05-01 實施
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文檔簡介

ICS07080

A40.

中華人民共和國國家標準

GB/T34776—2017

T4DNA連接酶酶活及雜質檢測方法

T4DNAligase—Detectionmethodsofactivityandimpuritiesofenzyme

2017-11-01發布2018-05-01實施

中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局發布

中國國家標準化管理委員會

GB/T34776—2017

前言

本標準按照給出的規則起草

GB/T1.1—2009。

本標準由全國工具酶工作組歸口

(SAC/SWG11)。

本標準起草單位中國測試技術研究院深圳華因康基因科技有限公司福建華燦制藥有限公司

:、、。

本標準主要起草人周李華李懷平盛司潼孫登峰譚輝彪黃發燦金虹馬麗俠葉德萍李花

:、、、、、、、、、、

王智沈興中譚和平

、、。

Ⅰ

GB/T34776—2017

T4DNA連接酶酶活及雜質檢測方法

1范圍

本標準規定了連接酶的活力雜質的檢測方法

T4DNA、。

本標準適用于作為分子生物學研究用的連接酶

T4DNA。

2規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的凡是注日期的引用文件僅注日期的版本適用于本文

。,

件凡是不注日期的引用文件其最新版本包括所有的修改單適用于本文件

。,()。

分析實驗室用水規格和試驗方法

GB/T6682

電泳裝置

YY/T0087

醫用離心機

YY/T0657

移液器檢定規程

JJG646

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件

。

31

.

DNA連接酶DNAligase

一種封閉鏈上的缺口酶借助或水解提供的能量催化相鄰的核苷酸分子間羥

DNA,ATPNAD3'-

基和磷酸基形成磷酸二酯鍵

5'-。

注連接酶催化底物可以是或依據酶的類型不同反應中產生高能中間產物的輔助因子可以是

:DNADNARNA。,

或+

ATPNAD。

32

.

T4DNA連接酶T4DNAligase

一種噬菌體基因的編碼產物以作為輔助因子催化雙鏈或的磷酸末

T430,ATP,DNARNA5'-

端和羥基末端形成磷酸二酯鍵

3'-。

注帶有分子質量約為來源于轉化有連接酶表達載體的E.Coli菌株主要作用是催化

:His-Tag,70ku,T4DNA。

末端之間的連接修復雙鏈核酸中的單鏈切刻

DNA,。

33

.

酶活力單位unitactivity

在連接酶反應緩沖液中反應條件下能使的經消

20μL1×T4DNA,16℃,30min50%HindⅢ

化的片段端濃度為連接所需的酶量即為活力單位

λDNA[5'0.12μmol/L(300μg/mL)]1。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件

。

聚合酶鏈式反應

PCR(polymerasechainreaction)。

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