DNA中5-羥甲基胞嘧啶圖譜測定及在臨床中的應用技術參數名稱：5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜測定和分析技術名稱：nano-hmC-Seal，來源于芝加哥大學何川教授實驗室DNA用量：1ng~1ug（具體情況會根據5hmC在該物種中的含量進行小范圍調整）測序策略：NextSeq500/HiseqX10，PE38/PE150數據量：平均1.5G/6G，讀段數量2千萬以上周期：少量樣本（<10）25個工作日給出基本解讀分析；批量樣品根據實驗要求協商數據循環周期。服務范圍各類物種或者其他來源DNA中的5-羥甲基胞嘧啶基因圖譜繪制和對比分析；各類腫瘤臨床研究，包括腫瘤標記物的尋找、組織活檢、液體活檢、術后監控和用藥指導的研究；專業人員輔助實驗設計，定制個性化的5-羥甲基胞嘧啶科研方案；技術背景簡介5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）是5-甲基胞嘧啶（5mC）的主動去甲基化過程中的重要中間產物，被稱為“第六種DNA堿基”。2009年兩篇science文章發現了TET酶可以將5mC氧化成5hmC并在生理上發揮著重要的作用，5hmC也迅速成為科研的熱點。在接下來的幾年中，科學家發現5hmC和5mC一樣，是一種重要的表觀遺傳修飾。5hmC的基因分布可以精準對應基因活性調控，比5mC更加動態靈敏地反應基因表達狀態。2012年時，《Cell》雜志就有文章報道羥甲基胞嘧啶與黑色素瘤之間的緊密關系(Lianetal.,2012)。隨后又有多篇有影響力的學術文章進一步驗證了羥甲基胞嘧啶作為細胞發育、神經系統、腫瘤以及心血管疾病等的標記物。同表觀遺傳修飾5mC一樣，結合高通量測序的方法繪制特定情形下5hmC在全基因組上的基因圖譜顯得尤為重要。通過了解DNA中羥甲基化胞嘧啶在基因組上的分布，可以對應分析基因組的調控信息。我們的DNA羥甲基化檢測技術原理來自于2011年美國芝加哥大學何川教授發表在NatureBiotechnology的專利技術(Songetal.,2011)。該技術是利用糖基轉移酶的作用將含有疊氮基團的葡萄糖特異性的共價標記到片段化DNA的5hmC上，然后再通過高效的點擊化學反應接上biotin進行可實現高效的富集并構建DNA文庫；利用高通量測序并比對分析的方法即可以獲得5hmC在基因組上的分布情況。對于抗體富集的方法，該方法的富集效率更高，5hmC的基因圖譜更加精確。2016年，何川教授實驗室對該技術細節進行了優化，其nano-hmC-Seal的技術可檢測低至1000個細胞基因組中的5hmC修飾分布情況(Hanetal.,2016)。他們利用該技術檢測白血病模式小鼠中造血干細胞的5hmC圖譜，發現5hmC分布在白血病樣品與野生型樣品中有顯著差異，并獲得了不同類型造血干細胞中的羥甲基化差異性區域的序列特征（如下圖所示）。基于nano-hmC-Seal技術，我們實現了5hmC標記并富集等流程的標準化操作，具有極高的靈敏度，精準穩定的檢測來源更為廣泛的DNA樣本：1），從DNA使用量上看，該技術可操作低至1ng的游離核酸，高至1ug的組織樣本DNA；2），結合高通量測序，該技術可以分析任意物種中含有5hmC修飾的DNA樣本，進而分析其生理調控機制。服務特色該技術檢測靈敏度極高，樣品收集方便，起始樣本量少；標準化流程操作，避免因操作造成的偏差；表觀遺傳新領域，全基因組比對，獲取全基因組的羥甲基化分布，信息量大；根據個性化科研方案提供專業的且具有特色的數據分析，滿足發表文章的要求。技術開發流程采集樣本-運輸質檢-提取DNA-文庫構建-5hmC富集擴增-質控測序-數據解讀-數據報告并反饋數據分析基本解讀：測序數據比對至基因組，給出樣本在基因區域的羥甲基化含量分布深度解讀：在對照組與實驗組之間進行統計分析，找出羥甲基化含量分布的顯著差異，出具報告輔助臨床診斷與治療。樣本要求人：8ml外周血或者相關組織樣品，及其相關臨床資料（性別、年齡、基本診斷等，作為臨床分析用）；其他物種：組織樣品DNA或者較大量的血液。臨床應用舉例1、DNA的5-羥甲基胞嘧啶修飾在結直腸癌液體活檢中的研究應用。為了尋找5hmC作為結腸癌臨床診斷中的潛在價值，我們分析比較結直腸癌患者和健康志愿者的細胞游離DNA（cfDNA）中5hmC的含量分布并嘗試尋找腫瘤標記物。我們基于改進的nano-hmC-Seal技術對53名健康志愿者和38名結直腸癌患者的血漿樣品中cfDNA進行5hmC修飾分布的檢測。這些生物樣品收集后被分成兩批，在第一批樣品中分析尋找癌患和健康人之間具有顯著性差異的5hmC基因位點并進行回歸模型構建，并在第二批樣品中進行效果驗證。最后我們也分析通過判定的分數對于癌癥病理分期和預后效果的相關性進行一定的研究。第一批樣品中有14例癌癥和18例正常對照，第二批樣品有24例癌癥和35例正常對照。在第一批樣品的cfDNA中，通過對比健康對照組和癌癥組樣品中5hmC的基因圖譜差異，我們分析出7,976個有顯著差異性的5hmC基因位點，將這些差異性位點中5hmC升高和降低最多的各前50個位點用來進行分層聚類分析，可以有效地把第二批樣品中的癌癥和健康個體分離開來（如圖A）。與傳統生物標記進行比較，包括癌胚抗原CEA，糖類抗原724，和糖類抗原125，cfDNA中基于5hmC分布的腫瘤標記物在腫瘤診斷上明顯有更高的靈敏性和特異性（5hmC診斷有92%的靈敏度，而傳統生物標記的綜合靈敏度只有45.7%）。這樣的結果已經接近于金標準腸鏡的檢測效果。A.我們進一步利用這些5hmC差異性位點進行分析，建立回歸模型，對第二批樣品做癌癥分類，并生成受試者工作特征曲線（ROC）。在第二批樣品的病人分類中，這種預測算法達到了92%靈敏度和86%的特異性（曲線下面積AUC=0.96）（如圖B左）。B.最后，利用回歸模型對所有的癌癥術前樣品和兩例癌癥術后樣品進行分數判定，以0.5為閾值的情況下，我們結合判分和癌癥樣品的病理分期進行作圖（圖B右），發現隨著病理分期的發展（I~III期），該模型給出的結果基本上呈正相關趨勢，IV期樣本由于癌細胞已經發生轉移，其腸癌細胞的特性已經發生改變因而無法準確判分。意料之中的是經過手術且腸鏡診斷未復發的患者樣品也同樣判定為健康狀態。這些結果說明通過血液中5hmC的腫瘤標記物篩查，我們可以高選擇性高靈敏性的分出腸癌患者和健康患者，并且對于癌癥患者的預后和復發監控，該回歸模型能給出明確的指導。2、5-羥甲基胞嘧啶在結直腸癌組織樣品中的DNA修飾差異研究。為了進一步研究癌癥組織與健康組織的差異，我們獲取了配對的癌癥組織和癌旁組織并進行了5hmC的基因圖譜檢測。結果如圖C，由顯著性差異的位點做聚類分析形成的熱圖清晰的顯示了結直腸癌癌癥組織與癌旁組織中的基因表達調控的差異。這些結果對于后續研究中進一步揭示癌癥的發生、發展機制和癌癥治療提供了鋪墊。C.參考資料Han,D.,Lu,X.,Shih,A.H.,Nie,J.,You,Q.,Xu,M.M.,...He,C.(2016).AHighlySensitiveandRobustMethodforGenome-wide5hmCProfilingofRareCellPopulations.Mol.Cell,63(4),711-719.doi:10.1016/j.molcel.2016.06.028Lian,C.G.,Xu,Y.,Ceol,C.,Wu,F.,Larson,A.,Dresser,K.,...Shi,Y.G.(2012).Lossof5-hydroxymethylcytosineisanepigenetichallmarkofmelanoma.Cell,150(6),1135-1146.doi:10.1016/j.cell.2012.07.033Song,C.X.,Szulwach,K.E.,Fu,Y.,Dai,Q.,Yi,C.,Li,X.,...He,C.(2011).Selectivechemicallabelingrevealsthegenome-widedistributionof5-hydroxymethylcytosine.NatBiotechnol,29(1),68-72.doi:10.1038/nbt.1732附件：樣品送樣標準(1)血液樣品：使用cfDTM游離核酸采血管或者DNAstreck游離核酸采血管進行血樣收集，常溫保存運輸并且于采血后72小時內送至我司進行樣品處理。（2）血漿樣品：常規采血管收集的血液樣品在4小時內進行處理獲得血漿。血漿顏色為淡黃色，不存在溶血的情況。血漿獲取的具體處理方法見下：1）將采血管在4度使用1350g轉速離心12分鐘，分離上層血漿于2mL離心管中；2）