植物組織培養實用技術花卉組織培養實用技術(以非洲菊為例)非洲菊組織培養技術非洲菊屬多年生草本花卉。重瓣花，花色有紅、橙紅、淡紅、白色，花色艷麗，可用作切花生產或盆栽觀賞。傳統的繁殖方法為播種或分株繁殖，但非洲菊種子壽命短、發芽率低，而且播種繁殖變異率很高，難以得到性狀一致的種苗，因而不能用于規模生產；而分株繁殖則存在繁殖慢，易退化和傳播病害，也不適于現代的大規模生產，因而目前國外一般都采用組織培養的方法來生產種苗。一．外植體的選擇

1、文獻資料綜述莖尖是一種較好的外植體，出愈率最高、繁殖速度快，但取材有限、滅菌很易產生藥害。幼葉、幼葉柄、花梗作為外植體，可誘導產生愈傷組織，但是誘導成苗難。花托是非洲菊組織培養中比較理想的外植體，其好處在于花托較大，易于剝取，并有花被包裏，污染程度輕，易于消毒，污染率低首先要選擇花大、花色艷麗、市場流行的品種，然后再選擇無病蟲害、植株生長健壯、花色純正的優良品種單株進行取材。作為外植體的花蕾要選取直徑在1.0cm左右，而且未露心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能獲得滿意的效果。2外植體的選擇方法

二．外植體的消毒方法1

1、剝去外層萼片，在自來水下沖洗干凈

2、置0.15%的升汞溶液中浸泡12~15分鐘

3、取出后剝去外部所有萼片,在1%的次氯酸鈉溶液中消毒10分鐘

4、放入無菌水中充分洗滌3次方法21、剝去外層萼片，在自來水下沖洗干凈

2、置70%酒精浸泡30秒

2、用0.1%升汞加數滴吐溫浸泡5～8分鐘

3、無菌水沖洗6～7次三．外植體的原代培養1、將滅菌后的花蕾外植體，剪成1.0cm長的小段2、在超凈工作臺上用0.1%氯化汞（HgCl2）對外植體進行表面消毒6~8min，小心傾去氯化汞溶液3、用無菌水沖洗6~7次4、接種在MS+BA1㎎/L+IAA0.5mg/L誘導芽培養基上四．試管苗的增殖與繼代培養培養6~7周以后，愈傷組織上陸續有小芽分化，此時將帶有小芽的愈傷組織切成2~4個小塊，分別移到MS+BA0.2～1㎎/L+NAA0.2mg/L﹢KT0.3mg/L誘導芽培養基上。培養一段時間后，又有小芽陸續分化。培養4周后，把這些繼代培養的芽叢分割，并移到新鮮的培養基上。每次繼代培養時間約為4周，芽叢的發生力可保持半年左右。在每次繼代前，高于3cm的小苗轉入培養基：1/2MS+BA1mg/L上，可促進幼苗迅速長大。注意1、在初級培養和繼代培養時，降低MS中的氮素營養會導致芽的發生率降低，銨態氮和硝態氮之比為1：2時對非洲菊芽的增殖最好。2、隨BA濃度的提高，增殖速度相應提高。但在較高的BA濃度條件下芽苗會變細、變弱，且隨BA濃度進一步提高，芽苗變得更加叢生、細弱。3、生產中在努力提高芽苗增殖率的同時，還應保證分生芽苗的健壯。根據品種不同,一般把增殖率控制在2.5-5.0之間。五．試管苗的壯苗與生根將長高的無根苗(2～3㎝)轉移到生根培養基，誘導根培養基：1/2MS+NAA0.1mg/L。7～8天后，小苗基部會長出3～5條不定根，12～15天就可以出瓶，生根率達到95%以上。附加蔗糖30mg/l、瓊脂7g/L,pH6.0。培養溫度25~27℃，光照12～14小時，光照強度2000lx。在無糖的MS培養基上,植株生根快,且生根率高。無糖或低糖培養所生根系發達，呈白色，試管苗過渡成活率高。糖的濃度以0～1.5%為好,低鹽培養基生根效果較好。六．試管苗的移栽與田間管理欲移栽的組培苗先去掉瓶蓋通風煉苗，3天后將生根苗洗凈根部附著物，移入溫室內的珍珠巖+腐殖土（1：1）基質中，繼續訓化一周內保持遮光80％和適當的濕度，濕度以60%～70%為宜，溫度15～25℃。一周后，適當增加光照，且每周淋一次無機液肥。在2周內保持較高的空氣相對濕度，3周時幼苗長出白根，新葉抽出。一個月左右長出4片新葉，株高6～8厘米，可大定植或上市出售，移栽成活率97%。草莓組織培養技術草莓屬多年生草本植物，植株矮小。草莓的莖呈短縮狀，地上短縮莖節間極短，節密集。地下短縮莖為多年生，可發育成不定根。葉屬于基生三出復葉，離生雄、雌蕊離生。果實為假果，主要是花托膨大肉質化形成，瘦果以聚合果形式生于花托上。果實成熟時果肉紅色，粉紅色或白色。一、外植體的選擇選擇結果性優良的草莓母株上新抽出的匍匐莖作外植體，以每年6～7月份最為適宜。在無病蟲害的田塊，連續晴天3～4d時選取生長健壯、新萌發且未著地的匍匐莖段3cm長作外植體。二、外植體的消毒消毒步驟①用洗滌靈水溶液洗去材料表面的油質②用70％的乙醇浸泡數秒以除去表面的蠟質③用3％的次氯酸鈉溶液浸泡消毒15～30min，然后用無菌水沖洗3次把芽放在解剖鏡下，無菌條件下，用鑷子、刀片、解剖針等工具把芽外面的幼葉和葉原基除去，使生長點暴露。用利刀切下含有1～2個葉原基，大小為０.5mm的生長點。三、外植體的原代培養莖尖分離后，迅速接入MS+6BA０.5mg／L+IBA0.1mg／L原代培養基中。培養條件為22～25℃，日照16～18h/d，光強3000Lx。注意在低溫和短日照下，莖尖有可能進入休眠，所以較高的溫度和充足的光照時間必須保證。經2～3個月的培養，可生長分化出芽叢，一般每簇芽叢含20～30個小芽為適。四、試管苗的增殖與繼代培養把芽叢割成芽叢小塊，轉入MS+6－ＢＡ１mg／L培養基中，令其長大，以利分株，待苗長大到1～2cm時，可將叢芽分成有3～4個芽的小芽叢，再轉入前述的分化培養基中，又會重復上述過程，達到擴大繁殖的目的。經過3～4周的增殖培養可獲得由30～40個腋芽形成的芽叢及植株。五、試管苗的生根與練苗生根培養基為1/2MS+IBAl.0mg／L，可使發根整齊，由于草莓地下部分生長快，發根力較強，也可將具有兩片以上正常葉的新莖從試管中取出進行試管外生根。健壯的生根苗，應將芽叢切割開，單個芽轉接到專門的生根培養基中生根，培養4周后，可長成約4--5cm高并有5～6條根的健壯苗。溫度保持在23℃左右，光照度2000Lx，12h光照。試管苗馴化時，用鑷子把草莓苗從試管瓶中取出，洗掉根系附帶的瓊脂培養基。培養土以等量的腐殖土和河砂為好，用蒸汽消毒。在溫室內馴化，栽前壓實，澆透水，用竹簽在缽中央打一小孔，將試管苗插入其中，壓實苗基部周圍基質，栽后輕澆薄水，以利幼苗基部和基質密合。以后每天葉面噴水3~4次，4~5d就成活，展開新葉。當檢查有一定的根系生出，可逐漸降低濕度和土壤含水量，進入正常幼苗的生長發育管理階段。六、試管苗的移栽與田間管理為提高母株的繁殖株數可采用5mg/L赤霉素,每株5ml處理和摘蕾的方法。在5月上旬和6月上旬分兩次進行。摘蕾可減輕母株的營養負擔，促使匍匐莖的大量發生，田間地每一株可繁殖150～200株。母株必須保證每株有大于3.3m2的營養面積。再是注意匍匐莖排列位置，不要交錯重疊，不利采苗，采苗也要適時進行。無論秋季或春季種植，繁殖床必須要進行土壤消毒，小面積可用蒸氣劑料混合消毒，可防治草莓萎縮病、根腐病、萎凋病等的發生。

龍牙百合組織培養技術龍牙百合屬百合科、百合屬、百合種，藥食兼用，是上等的滋補佳品，栽培經濟效益好。百合繁殖方法主要有分球繁殖、鱗心繁殖、鱗片繁殖等，但經多代無性繁殖以后，導致病毒積累、種性退化，嚴重地制約著百合產量和質量的提高。利用組織培養與脫毒技術相結合，能夠迅速去除無性繁殖體內病毒，復壯品種，并可加快百合的快速繁殖速度。龍牙百合特征:鱗莖，無皮，廣卵形，外部鱗片長,將整個鱗莖包裹，直徑5~15厘米，白色，莖高90厘米左右，直立莖上葉多而散生，披針形，葉色從濃綠，光滑。花單生莖頂。花朵呈喇叭狀長筒形，白色，有清香。一、外植體的選擇龍牙百合的許多器官、組織都可作為外植體，如鱗片、花梗、葉片、莖尖、腋芽、花瓣、花托、花絲、花藥、胚、子房、根尖等，其中采用鱗片作外植體的較多。以鱗片為例，在選取外植體時，要選擇具備龍牙百合品種特征、無病蟲害危害的種球。外部鱗片易污染要將其剝離，中部鱗片肉質厚，生長勢強，易誘導小鱗莖，是最佳的外植體。內部鱗片幼嫩，誘導率低，不易產生小鱗莖，故不宜采用。就季節性而言，以秋、冬季的鱗片分化成小鱗莖的能力最強，二、外植體的消毒由于龍牙百合鱗莖都生長在土中，受土壤微生物的影響，所以一般都會有污染。為此外植體消毒要嚴加注意，鱗片先用流線形自來水沖洗12小時以上進行預滅菌再用70%酒精消毒1min，用0.1%升汞消毒10min最后用無菌水沖洗4~6次，用無菌吸水紙吸干水分。三、外植體的原代培養在同一塊鱗片上，其中部被誘導產生小鱗莖的能力最強，誘導出的小鱗莖生長速度也相對較快，而兩頭位置相對要差些，所以在進行原代培養時，要取已消毒外植體的中部將其切成1~2cm2大小，背部朝下置于MS+NAA0.03mg/kg+瓊脂0.7%+蔗糖3%培養基上培養。培養條件為：溫度控制在23±2℃，光照控制在300~500Lx進行脫分化，之后溫度控制在25±2℃，每天10h小時1500Lx光照。在龍牙百合組織培養過程中，鱗片誘導產生小鱗莖的過程是比較緩慢的，一般為30天以上，在鱗片上分化出多個肉眼可見的針尖大小的小突起。40天左右發育成球狀的可見鱗片的小鱗莖。四、龍牙百合的繼代培養鱗莖原代培養形成再生芽繼代培養生根培養馴化移栽大田培植大田培植龍牙百合組織培養技術路線回顧原代培養形成愈傷組織四、試管苗的繼代培養1、龍牙百合繼代培養路線思考分離小鱗莖培養繼代目的：以盡可能少的時間獲取盡可能多的組織苗，通過生根、馴化、移栽、培植，為生產提供大量種苗怎樣短期獲取大量組培苗？愈傷組織培養→芽誘導再生小鱗片剝離培養小鱗莖增重較快，但增殖率較小，僅100~200%增殖率較高，有300%~500%，但小鱗莖增重慢。用增重培養基與液體培養方法可解決增殖率最高，可達500%以上，短期內可誘導出大量愈傷組織。通過芽誘導，用增重培養基與液體培養方法可獲取大量組培苗剪取莖段培養不產生伸長莖段，此法不宜采用3、繼代培養1）分離小鱗莖培養選擇直徑達到0.5cm大小的小鱗莖，用鑷子將其輕輕剝離，置于增殖培養基中。把原來的鱗片重新轉到新鮮的誘導培養基上繼續誘導小鱗莖，小鱗莖還會在其他的部位產生，整個生長周期可以延續5~6個月。小鱗莖繼代培養30天左右可增殖1~2倍。開始是在鱗莖基部產生小鱗莖，40天左右小鱗莖長大，形成叢鱗莖。小鱗莖慢慢抽出新芽，然后形成小植株。此時可把叢芽切割繼續培養增殖。2）再生小鱗片剝離培養選擇直徑達到0.5cm大小的小鱗莖，將其小鱗片分離下來，不用切割，直接接種到分化培養基上。20d后，在小鱗片基部會出現3~5個小突起，以后發育成小鱗莖。多數次生小鱗莖會抽生細長葉片，造成小鱗莖不飽滿；不抽生葉片的小鱗莖相對要肥厚一些。如此反復進行,可以使繁殖中間體得到快速增殖,但不可超過6代以上,否則分化率下降，小鱗莖細弱。4、增重培養直徑達到1cm以上即可進行生根培養，對于達不到此標準的小鱗莖，接種到增重培養基中，在此種培養基上，小鱗莖較少長葉而明顯增重。如果能采用液體振蕩培養，則增重效果更佳。一般轉速設為110r/min。是否可以進行淺層液體靜置培養，尚需試驗。五、試管苗的生根與練苗將叢生的試管芽切成單株，接種在1/2MS+IBA0.5mg/L+活性炭0.5%生根培養基上，7天后芽基部開始形成根尖。慢慢伸長成輻射狀白色的小根。20天后根長達7~10cm，基部稍膨大。溫度設置為25~28℃，光照強度為1500Lx．每天給予10~12h光照。當試管苗長成具4~5片葉，3~4條根，7cm左右高時，在自然光照和溫度條件下煉20d可移栽。六、試管苗的移栽與田間管理移栽時將試管苗根部的培養基洗干凈再移栽。龍牙百合試管苗比較嬌嫩，移栽幼苗最好用消毒的腐殖土或草炭+蛭石(2:1)的基質中，育苗盤必須清洗消毒。水分管理百合鱗莖由許多肥厚的鱗片組成，鱗片內貯存有許多水分和養分。一般來說，百合是比較耐旱的。但百合有眾多柔嫩多汁的莖葉，需要由充足的水分來支撐。因此，在百合正常生長過程中，需要比較充足的水分，才能保證莖葉的生長和花蕾的發育。如果栽植后澆水不透或土壤濕度過大或棚內濕度過高，對生長不利，易出現徒長，莖葉軟弱。在棚室栽培中如土壤干旱，應在晴天上午澆水，增加棚室內的濕度。切忌在中午日照強烈、氣溫很高時澆水或噴水，否則易引起百合芽枯病等生理性病害的發生。施肥管理百合的根系十分發達，吸收水分和養分的能力很強，生長期間給予一定數量的氮、磷、鉀肥（比例為5：10：5）外，還需補充鈣、鎂、硫等肥料以及鐵、硼、錳、銅、鋅、銅等微量元素。百合無論在莖葉生長期、現蕾開花期和地下鱗莖膨大期，都需要足夠的營養。在百合莖葉生長期，可施用2-3次稀釋的餅肥液。硝態氮肥不易