中西醫結合南方紅豆杉對肺癌A549細胞的抑制作用及EGFR等靶點研2010年浙江省中 A549肺癌及對EGFR等靶點的 項目編號 一．立論依據（包括課題理由、研究意義、國內外研究現狀分析和主要參考文獻性支氣管肺癌是目前世界上最常見的之一，率早中居于前列。時，80%患者已失去手術根治可能，90%須接受化療。但是，化療對腫瘤細胞易對正常細胞產生毒性損傷，導致嚴重的藥物毒副反應發生且療效有限。非小細胞肺癌（Non-SmallcelllungCancer）510%，小細胞肺癌（SmallcelllungCancer）3%，療效很不理想。多年來，科研人病理研究是最為熱點的領域[1]。分子靶向是靶向治療中特異性最它針對的是可能導變的各個環receptor，EGFR（1）（2）receptorEGFRkinaseTK域。其胞內區域與erbB癌產物高度同源，胞外配體結合EGFR后引起EGFR構型改變，導致EGFR同二聚體或其他相關受體異聚化而活化它們的胞漿位點[4,5]EGFR（EGFEGFEGFRHER-2EGFR形成同源二聚體，而有著HER2異二聚體的功能較強。受體的二聚體化激活受體的膜內酪氨酸激酶，使其自身磷酸化，磷酸化的酪氨SH2PTB區的胞內信號分子（PLC-γ，grb2、Cbl等）結合后，將主要由有絲（3（3K/Akt-T通路把信號傳遞到細胞核內使轉錄增加促進細胞的增殖轉化[6]因此其作為治療靶點早已有提出并日益受到人們關注其中針對肺癌EGR酪氨酸激酶的易瑞Iessa和特羅（arcev也先后上市療效確切。但其價格讓患者及其家屬重負，受用者了了。Brambilla-E研究認為[8]，肺癌的發生、發展是多、多步驟過程的結果，在惡變前狀態，bal-2/bax比例失衡有助于細胞擴增。因為對細胞的易感性受控于胞質內bcl-2成分諸如bal-2和bax間的平衡，bax可促進細胞凋亡，所以其被看作抑癌Bax低表達有利于癌細胞存活，bcl-2高表達有利于癌細胞的擴增癌旁組織早期中bcl-2和bax的比例常有改變。兩者比例能決定細胞的轉化，其比例高，則易發展為癌。抑制凋 過表達促凋亡bax低表達，可使細胞凋亡抑制，細胞存活期延長擴增，這是肺癌發生的重要機制之一[9]。環氧化酶（cyclooxygenase,COX-2）是催化花生四烯酸轉變為素和血栓素的限速酶，與機體的各種生理病理過程密切相關，有兩種同工酶：COX-1、COX-2COX-1COX-2的結構相似，但在組織中的分布和功能都不盡相同。COX-2NSCLCNSCLC預后不良的獨立預紅豆杉中有40多種有效成分，其中主要有：紫杉醇、紅豆杉多糖、巴卡亭Ⅲ、生物堿、紫衫黃酮、萜類、小分子類物質（鞣質）等。紅豆杉細胞提取物可通過誘導腫瘤細胞SMMC-7721和Hep-2發生凋亡，抑制腫瘤 1、2、腫瘤壞死因子，干擾素等細胞因子的合成；激活巨噬細胞、T淋巴細胞， 研究員曾于2006年5月20SD660180天，大鼠各項生理者歡迎。但迄今為止，尚無南方紅豆杉靶向治療抑制腫瘤機理研究。若能從分子水平加以闡述，揭昂貴的靶向治療西藥費用，減輕患者及其家屬沉重負擔，而且對中的發掘、整理、提高及世界有重 [2]．韓寶惠主編.腫瘤生物免疫靶向治療 科學技 ，魏金星，等.腎細胞癌中血管密度與腫瘤細胞凋亡的關系[J].中華實驗外 [4]．PaoW,MillerVA.Epidermalgrowthfactorreceptormutations,small-moleculekinaseinhibitors,andnon-small-celllungcancer:currentknowledgeandfuturedirections[J].JClinOncol,2005,23(11):2556-[5]．WangChengxin,CaoYA.AtumortheapytargetingEGFRandit`smutation[J].JournalofInternationalPathologyandClinicalMedicine,2000,20(2):137-140. 2004,31（1：26-[7]．，梁婷婷，宋文哲.Survivin在腫瘤中的研究進展[J].中國醫，2004,39（5：22-[8]．Brambilla-E,Gazzeri-S,Lantuejoul-S,etal.p53mutantimmunophenotypeandderegulationofp53transcriptionpathway(bcl-2,bax,andwafl)inprecursorbronchiallesionoflingcancer.Clin-cancer-Res,1998,4(7):1609-[9]．Zhang-H,Yousem-SA,Franklin-WA,etal.Differetiationandprogrammedcelldeath-relatedintermediatebiomarkersforthedevelopmentofnon-smallcelllungcancer:apilotstudy.Hum-Pathol,1998,29(9):965-[10]．ReddyBS,RaoCV,SeibertK.Evaluationofcyclooxygenase-2inhibitorforpotentialchemopreventivepropertiesincoloncarcinogenesis[J].CancerRes,1996,56(3):4566-4569.[11]．SweeneyCJ.Whycycooxygenase-2inhibitorpluschemotherapy[J].AmJClinOnocol(CCT),2003,26(4):[12]．MeertAP,MartinB,DelmotteP,etal,TheroleofEGFR-Rexpressiononpatientsurvivalinlungcancer,asystematicreviewwithmeta-ysis[J].EurRespirJ,2002,20(4):975-998.[13]．，梅興國，龔偉等.SMMC-7721HEp22的作用研究，中國藥2003,19（7：801-[14]．本樣主編.現代中藥藥理學[M].第一版.：科學技術，1999,1449-二通過體內外實驗，觀察南方紅豆杉對人肺癌A549細胞生長的影響，并探討其如何對人肺癌A549細胞A549A549細胞株增殖的，EGFR總蛋白和蛋白磷酸化表達（Western-Bloting技術）變化情況，EGFR、Survivin、bcl-2、bax、cox-2（ELISA法）A549細胞株增殖的主要靶點，為進一步開展相應信號傳 對于3種方法對于上述 分為中劑量特羅凱3.5mg/kg/d組，標準劑量特羅凱7mg/kg/d組，低劑量紅豆杉186.65mg/kg/d組，中劑量紅豆杉373.3mg/kg/d組，高劑量紅豆杉746.6mg/kg/d組，中劑量紅豆杉373.3mg/kg/d+中劑量特羅凱3.5mg/kg/d時后，清醒狀態下無菌心臟采血，分離，同組兔混合，過濾除菌，-20℃保存備用。組，10%中劑量特羅凱組，10%標準劑量特羅凱組，10%低劑量紅豆杉組，10%中劑量紅豆杉組，10%624、488A549細胞株增殖的影響（MTT法EGFR、Survivin、bcl-2、bax、）變化情況，EGFR、Survivin、bcl-2、bax、cox-2水平檢測（ELISA法）統計學處理：以SPSS統計軟件包進行統計分析，正態分布的各項資料均以均數±標準差表示，采用t檢x2檢驗、直線相關與回歸等。 A549 組

中 標劑 準量 劑特 量羅 特++凱 羅++ 組（MTT（MTT法ELISA技術測定2的表達RT-PCR技術測 、COX-2mRNA的表達技術測定COX-2bax總蛋南方紅豆杉由寧波泰康紅豆杉生物工 制成顆粒劑，8克/包，于正規途徑購得細胞系：人肺癌A549細胞株引 細胞生 實驗動物：購自浙江 大學實驗動物中心含藥的：選擇純種新西蘭家兔162kg8組，根據人和動物體表面積折算的3.5mg/kg/d7mg/kg/d186.65mg/kg/d特羅凱3.5mg/kg/d組，中劑量紅豆杉373.3mg/kg/d+標準劑量特羅凱7mg/kg/d組，及對照組。連續灌胃31小時后，清醒狀態下無菌心臟采血，分離，同組兔混合，過濾除菌，-20℃保存南方紅豆杉對人肺癌A549細胞生長的影響：取對數期A549細胞，接種于96孔板，分別設10%鹽水血清組，10%中劑量特羅凱組，10%標準劑量特羅凱組，10%低劑量紅豆杉組，10%中劑量紅豆杉組，每組設6個復孔，分別培養24、48小時后終止實驗，觀察腫瘤細胞的增殖活性，收集上清液和細胞EGFR變化情況，EGFR、Survivin、bcl-2、bax、cox-2水平檢測（ELISA法）SPSSt檢A549細胞，得到通過體內代謝的實驗，觀察南方紅豆杉對肺癌A549細胞生長的影響，并探討如何對人肺癌A549細胞EGFR、COX-2mRNA、Survivin、bax、bcl-2及總蛋白的表達進行干預，揭示南方紅豆杉抗肺癌A549細胞通過南方紅豆杉抗人肺癌A549細胞生長機理及靶點的研究，探討其安全、有效的劑量，開拓中藥分子 于浙江中大學動物實驗中心兔 于浙江省中醫院中心探索南方紅豆杉含藥抑制肺癌A549細胞生長的作用 測定EGFR、COX-2mRNA、Survivin、bax、bcl-2及總蛋白的表達明確含藥不同濃度的南方紅豆杉對肺癌A549細胞株有一定的抑制作用及主要作用靶點。動物實驗部