MTT法檢測細胞活力講解MTT法目的和意義檢測細胞存活和生長情況用于評價藥物產生的細胞毒作用原理四唑鹽（噻唑藍）是一種能接受氫原子的染料，簡稱MTT活細胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的紫藍色結晶物，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量，從而反映細胞的增殖情況。在一定細胞數范圍內，MTT結晶物形成的量與活細胞數成正比。活細胞+MTT琥珀酸脫氫酶紫藍色結晶物Formazan貼壁細胞操作步驟1.

接種細胞：用0.25%胰蛋白酶消化單層培養細胞，用含血清的培養液配成單個細胞懸液，以每孔2000-3000個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積90ul。（邊緣孔用PBS或空白培養基填充）。

2.

培養細胞：將培養板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板，大約12h），加入濃度梯度的藥物。原則上，細胞貼壁后即可加藥，每孔加藥10ul，一般設5個復孔。3.5%CO2，37℃孵育分別孵育24小時后，倒置顯微鏡下觀察。4.每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養液。5.終止培養，小心吸去孔內培養液。6.每孔加入100ul二甲基亞砜（置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。7.同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜）

懸浮細胞操作步驟：1）將細胞離心收集后，調節細胞懸液濃度大約1×104/ml，每孔先加細胞懸液90ul,相應梯度的藥物每孔10ul；共100ul加入到96孔板（邊緣孔用PBS填充）。每板設對照。同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞砜），對照孔（細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜），每組設5個復孔。2）置37℃，5%CO2孵育24小時，倒置顯微鏡下觀察。3）每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4h4）每孔加三聯裂解液（10gSDS，異丁醇5ml，用雙蒸水溶解配成100ml）過夜，第二天早晨置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm測量各孔的吸光值。藥物的配制濃度體積過濾MTT的配制MTT一般最好現用現配，過濾后4oC避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，因為時間較短。實驗結果統計學處理所有數值以x±s表示，應用SPSS軟件進行方差分析，時為相差顯著，時為相差非常顯著。可以以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生線曲線，專門公式求IC50（半數抑制濃度）。或計算抑制率。

OD對照組-OD實驗組抑制率%=OD對照組×100%實驗結果統計學處理公式如下：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg最大劑量

I:lg(最大劑量/相臨劑量)

P:陽性反應率之和

Pm:最大陽性反應率

Pn:最小陽性反應率舉例藥物濃度、、、、、，稀釋倍數為10，最大濃度為，抑制率為、、、、，。代入

計算公式：

Xm=lg0.1=-1

注意事項1．

選擇適當的細胞接種濃度。在進行MTT試驗前，對每一種細胞都應測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，然后確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間。

2．

設空白對照，與試驗平行設不加細胞只加培養液的空白對照孔。最后比色時，以空白孔調零。實驗前應明確的問題1.選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以保證培養終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀察不到差異。2.藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。3.時間點的設定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，最后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現的最明顯）。4.培養時間。100ul的培養液對于10的4～5次方的增殖期細胞來說，很難維持68h，如果營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結果，我們是在48h換液的。

法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。做MTT時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。

7.實驗時應設置調零孔，對照孔，加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質，而加藥組加入不同濃度的藥物。

8.避免血清干擾。用含15％胎牛血清培養液培養細胞時，高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10％胎牛血清的培養液進行。在呈色后，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。關于細胞的接種(鋪板)細胞過了30代以后就不要用了;培養板要用好的（最好進口板），不好的板或重復利用的板只可做預實驗。接種時最好按照預實驗摸索出的密度接種,且而細胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關系不佳。故而MTT細胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。細胞密度要根據不同細胞的特點來定。懸浮細胞每孔的細胞數可達到105,貼壁細胞可為103-104。

MTT本身就是比較粗的實驗，增殖率10%左右的波動都不算奇怪。特別是新手，20％的波動也是常見的，所以很可能是技術原因引起的，特別是種板技術一定要過關。注意細胞懸液一定要混勻，已避免細胞沉淀下來，導致每孔中的細胞數量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。另外，吹散次數過多也會影響細胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。如何清除上清直接吸出：加DMSO前要把液體吸掉，但培養液里的紫色結晶可能會吸去，可在這之前先用平板離心機離心96孔板，2000r，5分鐘，然后吸掉上清(如果是懸浮細胞，則推薦此法,懸浮細胞要離心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圓底型96孔板,清除上清時注意不要把下面的結晶顆粒吸掉,建議各孔吸棄150-160ul即可)。翻轉倒扣法：可以直接將板翻轉倒扣（墊幾層濾紙）2－3次，比用“吸”的辦法更不容易使細胞脫離出來。可以輕拍，或者傾斜一點幫助吸液，但前提是細胞貼壁要比較牢。加入DMSO在同一批實驗中最好不要更換DMSO。加DMSO前把孔中液體盡量棄干凈如果培養液沒棄干凈，空白孔也要留有等量的培養液，這樣在檢測時可以盡量去除培養液的影響，DMSO的量也可為100ul或150ul.加了DMSO后用振蕩器輕輕振蕩5－10min,時間控制盡量嚴格一點,放置時間長了會影響結果,值會偏大,且結果不可信.加入DMSO溶解后盡快檢測。OD值的測定至于測定波長的選擇是因顯色溶液而異的。對于DMSO，溶解后呈紫（紅）色，490nm有最大吸收值。