MolecularBiologyChaper4TranscriptioninEukaryotes:MechanismandRegulationContent4.1EukaryoticRNApolymerases4.2EukaryoticPromoters4.3GeneralTranscriptionFactorsandInitiation4.4SpecificTranscriptionFactorsandTranscriptionalRegulation4.5Structuresofspecifictranscriptionfactors4.6ExperimentsTranscriptioninEukaryotes:MechanismandRegulationProkaryoteEukaryoteTranscriptioninprokaryotesTranscriptioninEukaryotes:MechanismandRegulationEukaryoticRNApolymeraseIIandtranscriptionfactorsSpecifictranscriptionfactorGeneraltranscriptionfactorsGeneraltranscriptionfactorsTranscriptioninEukaryotes:MechanismandRegulation表4.1表4.1核仁核基質核基質4.1EukaryoticRNApolymerasesLocationsofRNApolymeraseNucleolus(RNApolymeraseI)Nucleoplasm(RNApolymeraseIIandIII)RNApolymeraseIrRNAprecursorProcessing5.8SrRNA18SrRNA28SrRNARNApolymeraseIRNApolymeraseIIRNApolymeraseIIRNAprecursorProcessingsnRNAsTranslationProteinmRNAHoloenzyme:

Coreenzyme(β’,β&α)+SubunitσRNApolII:

Coresubunits(1,2&3)+Subunits4-12RNApolymeraseIIRpb1、Rpb2和Rpb3稱為‘核心亞基’RNApolymeraseII蟹鉗RNApolymeraseIIIRNApolymeraseIIIRNAprecursorProcessing5SrRNA4.5StRNAU6snRNATranscriptioninEukaryotesTranscripitionofrRNAgeneTranscripitionoftRNAand5SrRNAgeneTranscripitionofmRNAandsnRNAgenes

RNAPolIRNAPolIIRNAPolIIImRNAThreetypesofRNApolymeraseanditstranscriptinEukaryotes4.2EukayoticPromoters4.2EukayoticPromotersProkaryoticpromoterEukaryoticpromoter4.2EukaryoticPromotersTATA框起始子TFIIB識別元件上游啟動子元件下游啟動子元件“IwouldliketohaveTATAboxandInitiatorasmypromoter.Whatwouldyoulike?”“Well,IpreferBREandDPE.”EukaryoticpromoterTATAAA-10boxTATAATTATAboxTATAboxSpecializedgenes+Housekeepinggenes–Genesofdevelopment–

TATA框最常出現在特殊的基因里GCGAT

DPE:DownstreamPromoterElementPyPyANPyPyTA驅動基礎轉錄

Initiator/起始子drivebasictranscriptionCGCCGGGCCABRE:TFIIB

RecognitionElement原核生物RNA聚合酶前起始復合體真核生物RNApolymeraseII:“Ineedhelpfromotherproteins.”4.3GeneralTranscriptionFactorsandInitiation4.3.1TFIIDTBP:TATA-BindingProteinShow3DstructureofTBPTBP與TATA框結合的圖片TAFIIs:TBP-AssociatedFactors

IITAFIIs:1)BindingtoDPEorInr結合到核心啟動子元件上而不是結合到TATA框上去促進轉錄。TAFIIs:2)BindingtoActivator與特異轉錄因子結合以增強或抑制轉錄4.3.2OtherTFIIs TFIID（TBP）結合TATAbox↓TFIIA和TFIIB結合BRE↓RNAPolII-TFIIFisrecruited↓TFIIEandTFIIHbindupstreamofPolIItoformthepre-initiationcomplex↓PromotermeltingusingenergyfromATPhydrolysisbyTFIIH)↓PromoterescapesafterthephosphorylationoftheCTDtail4.3.3GeneralTranscriptionfactors

forRNAPolymeraseIandIII

RNA聚合酶I和III的通用轉錄因子（1）GeneralTFsofRNApolymeraseISL1結合到核心元件上并幫助召集RNA聚合酶I到啟動子位置。UBF結合到上游啟動子元件幫助SL1結合到核心元件上。I類啟動子核心元件上游啟動子元件RNAPolIpromotersInitiationofpolⅠgene’stranscriptionUBFUBFSL1POLⅠNOTE:UBF----upstreambindingfactorSL1----selectivityfactor

5SrRNApromotertRNApromoter(2)RNApolymeraseIII的通用轉錄因子

①ThreetypesofpolIIIpromoters②InitiationoftranscriptionoftRNApromoter

GeneralTFsofRNApolymeraseIII③Initiationoftranscriptionof5SRNApromoter①EukaryotictRNApromoter②Eukaryotic5SrRNApromoterAboxBboxTATAbox+1-30-23AboxCboxTATAbox+1-30-23Promoters(啟動子)ofRNApol.IIITFCTFBTFATFCTFBTFⅢC+1內啟動子Abox+50~+65Cbox+81~+995srRNAgeneTFⅢBPolⅢTFⅢAPolⅢpromoter&transcriptioninitiation內啟動子AboxBboxtRNAgeneD-loopTψC-loop+1TFⅢCTFⅢBPolⅢ4.4SpecificTranscriptionFactorsandTranscriptionalRegulation

特異轉錄因子與轉錄調控Specifictranscriptionfactor真核生物采用特異轉錄因子的蛋白質來改變轉錄速率Specifictranscriptionfactors

特異性轉錄因子Specifictranscriptionfactors:

Eukaryoticfactorsthatchangetherateoftranscriptionoftargetgenes.特異性轉錄因子：改變目標基因轉錄速率的的真核生物因子。

Factors（因子）Proteins（蛋白質）Elements（元件）DNAsegments（DNA區段）Q→Whatarethetwotypesofspecifictranscriptionfactors?Howcantheyaffectinitiationoftranscription?

特異轉錄因子分哪兩種類型？

它們是如何影響轉錄起始的？SpecifictranscriptionfactorGeneraltranscriptionfactorsGeneraltranscriptionfactorsSpecificTranscriptionFactorsandTranscriptionalRegulation

特異轉錄因子與轉錄調控4.4.1Activators/激活蛋白4.4.2Repressors/阻遏蛋白Specifictranscriptionfactorsthatenhancetherateoftranscriptionarecalledactivators.Helprecruitthepre-initiationcomplex.Helporganizethesubunitsofthepre-initiationcomplex,andmaintaincohesionofthecomplex.AttractenzymestoloosenDNAfromproteins,freeingimportantregionslikethepromoter.4.4.1Activators/激活蛋白（1）概念（2）調控機理①Helprecruitthepre-initiationcomplex②Helporganizethesubunitsofthepre-initiationcomplex③AttractenzymestoloosenDNASpecifictranscriptionfactorsthatpreventthetranscriptionofagenearecalledrepressors.能阻礙基因轉錄的特異轉錄因子稱為阻遏蛋白。Blockingtheactivityofactivators.Blocking

accessofthepre-initiationcomplextothepromoter.RecruitingenzymesthattightenDNAaroundproteins.4.4.2Repressors/阻遏蛋白（1）概念（2）調控機理①Blockingtheactivityofactivators②Blockingaccessofthepre-initiationcomplextothepromoter.③RecruitingenzymesthattightenDNAaroundproteins順式作用元件（cis-actingelement）指與結構基因表達調控相關、能夠被基因調控蛋白特異性識別和結合的特異DNA序列。包括啟動子、上游啟動子元件、增強子等。指能直接或間接地識別或結合在各類順式作用元件核心序列上參與調控靶基因轉錄效率的蛋白質。

反式作用因子(trans-actingfactor)4.4.3EnhancersandSilencers

增強子和沉默子順式作用元件能與特異性轉錄因子結合，以決定轉錄的起始位點、轉錄效率及轉錄的時空特異性EnhancersandSilencersTranscriptionisactivatedEnhancerTranscriptionisrepressedSilencerRepressorActivator增強子是一類正調控順式作用元件，能夠從轉錄起始點的上游或下游數千個堿基處來激活轉錄，使和它連鎖的基因轉錄頻率明顯增加的DNA序列。

（1）增強子（Enhancers

）TranscriptionisactivatedEnhancerActivatorDNAlooping/DNA成環SeaUrchinEndo16gene

（海膽Endo16基因）Aredseaurchin紅海膽海膽Endo16基因的多增強子調控模式（2）沉默子（Silencers

）能夠同反式因子結合從而阻斷增強子及反式激活因子的作用，并最終抑制該基因的轉錄活性。TranscriptionisrepressedSilencerRepressorQuestionsQ1

→WhatkindsofDNA-bindingmotifsdoeukaryoticproteinshave?

真核生物具有什么樣的DNA結合基序?Q2

→HowdidweknowproductsofvariousRNApolymerases?

我們是如何知曉不同RNA聚合酶的產物的？Q3

→Areproteinmodulesexchange-able?

蛋白質模塊可以互換嗎？??ProkaryoticEukaryotic4.5特異轉錄因子的結構大溝A≠TG≠C小溝A≈TG≈C大溝VS小溝轉錄因子的結構DNA結合結構域轉錄活化結構域4.5.1DNA-BindingMotifsinProkaryotes原核生物DNA結合基序RecognitionhelixThehelix-turn-helix(HTH)motifHelix-turn-helix:AcommonDNA-bindingmotifinprokaryoticproteins.Consistsoftwoα-helicesconnectedbyashortpeptideturn.螺旋-轉角-螺旋：原核生物中常見的DNA結合基序。由兩個α-螺旋通過一個肽轉角連接在一起。)例子：lac阻遏蛋白Show3Dstructureofthelacrepressor例子：Trp阻遏蛋白TrpTrprepressorDNAE.coliOperator例子：Trp阻遏蛋白Show3Dstructureofthetrprepressor4.5.1DNA-BindingMotifsineukaryote 真核生物DNA結合基序(1)Thehomeodomain

同源異型域(2)Zincfingermotif

鋅指基序(3)Leucinezipper

亮氨酸拉鏈(4)HLHmotif

螺旋-環-螺旋基序?Eukaryotic(1)Thehomeodomain/同源異型域SimilartoHTHofprokaryotesHomeodomain:DNA-bindingdomainfoundinmanyeukaryoticproteinsthatareinvolvedinorganismaldevelopment.同源異形域：在許多真核生物中發現的DNA結合域，在生物發育中起作用。由短的肽鏈轉角連接在一起的三個α螺旋組成。其中兩個螺旋在一起看起來與HTH基序非常相似。SimilartoHTHofprokaryotes(1)Thehomeodomain/同源異型域與DNA大溝發生特異性接觸支撐作用肽鏈延伸段，深入到DNA的小溝①同源異型基因(Homeoticgenes)同源異型基因是指一類含有同源框的基因。在胚胎發育中的表達水平對于組織和器官的形成具有重要的調控作用。該類基因的突變，就會在胚胎發育過程中導致某一器官異位生長，即本來應該形成的正常結構被其他器官取代了。①同源異型基因(Homeoticgenes)廣泛存在于從酵母到人類的各種真核生物中的基因，其特點是基因中存在共同的180bp的DNA片段，編碼高度同源的60個氨基酸，這個共同的180bpDNA片段稱為同源異型框（homeobox）,含有同源異型框的基因稱之為同源異型基因。如果蠅的HOM基因，動物和人類的Hox基因。在胚胎發育中起著類似萬能開關的作用，保證生物在正常的位置發育出正常形態的軀干、肢體、頭顱等器官。②同源異型蛋白和同源異型域（homeodomain）由同源異形框基因編碼的蛋白質稱為同源異型蛋白。同源框由180個堿基組成，編碼一段稱為同源異形域的特定氨基酸序列（60aminoacids），稱為同源異型域。MutationofhomeoticgenesHomeoticgenes觸角足畸形突變同源異形基因負責在正確的位置發育出正確的器官Show3Dstructureofhomeodomain(2)Zincfingermotif/鋅指基序Zincfingers:DNAbindingdomainsthatareelongated,withashapethatissomewhatlikeafinger.Theshapeofthedomainiscoordinatedbyoneormorezincatoms.鋅指結構：伸展的、形狀有些像手指的DNA結合域。這一形狀由一個或多個鋅原子進行協調。OneproteinhasmultiplezincfingersFinger1Finger2Finger3Whysomany?(3)Leucinezipper/亮氨酸拉鏈Leucinezipper:ADNA-bindingdomainformedbytwoα-helices,usuallyfromtwodifferentproteinsthatcometogetherattheDNA.Thehelicesareheldtoeachotherbyhydrophobicinteraction,asbotharelinedwithleucineaminoacids.亮氨酸拉鏈：一種由兩個α螺旋組成的DNA結合域形式，通常由一起來到目標DNA的兩種不同蛋白質組成。兩個螺旋通過疏水相互作用而保持在一起，因為兩者都具有排布成一條線的亮氨酸。Show3Dstructureofleucinezipper這類蛋白質的DNA結合結構域實際是以堿性區和亮氨酸拉鏈結構域整體作為基礎的。Homodimerization/同源二聚化作用LeucineHomodimerization:

Formationofdimersbetweentwoidenticalsubunits.同源二聚化作用：兩個相同亞基之間形成二聚體的過程。Heterodimerization/異源二聚化作用Heterodimerization:

Formationofdimersbetweentwodifferentsubunits.異源二聚化作用：兩個不同亞基之間形成二聚體的過程。異源二聚體能夠識別不同的DNA序列，這一特性能夠使較少種類的蛋白產生出更多種類的DNA結合域。思考題：你克隆到的一個蛋白質，序列如下：

001

MESADFYEVEPRPPMSSHLQSPPHAPSNARLWLSPGRGPRAAPSPTCRPGAAGRICEHET

061

SIDISAYIDPAAFNDEFLADLFQHSRQQEKAKAAAGPAGGGGDFDYPGAPAGPGGAVMSA

121GAHGPPPGYGCAAAGYLDGRLEPLYERVGAPALRPLVIKQEPREEDEAKQLALAGLFPYQ

181PPPPPPPPHPHASPAHLAAPHLQFQIAHCGPTPPPTPVPSPHAAPALGAAGLPGPGSALK

241GLAGAHPDLRTGGGGGGSGAGAGKAKKSVDRDKAKQRNVELTQQKVELTSDNDRLRKRVE

301QLSREADTLRGIFRQLPESSVKLAMATARLARGCGTLAGRPPGLWRPRGWFRVAGSGCPG

361RASQD

根據已知的研究結果表明它是一個轉錄因子。從序列計算得到的分子量為40kDa，但從蛋白質用離心沉降方法得到的分子量為80kDa，你認為最可能的原因是什么?請根據你提出的假說設計試驗，并預測如果假說正確時的實驗結果。根掘氨基酸的序列，你認為什么特點使得這個蛋白質發生了你所提出的假說中的現象，并設計實驗加以驗證。(4)Helix-loop-helixmotif/螺旋-環-螺旋基序Thehelix-loop-helix(HLH)motifHelix-loop-helix/螺旋-環-螺旋Thehelix-loop-helix(HLH)motifHelix-loop-helix:ADNA-bindingdomaininproteins.Eachhalfofthedomainconsistsoftwoα-helicesconnectedbyapeptideloop.螺旋-環-螺旋：蛋白質的一種DNA結合域。該結合域的每一半由兩個α-螺旋通過一個肽環連接在一起。HLH基序由通過一個環連接在一起的兩個α螺旋組成。它也像一把鉗子一樣抓住DNA。HLH

versus

HTHThehelix-loop-helix(HLH)motifThehelix-turn-helix(HTH)motifShow3DstructureofHLH4.6Experiments /實驗研究4.6.1RNApolymerasetargets

RNA聚合酶的目標4.6.2ModularityofSpecificTranscriptionFactors

特異轉錄因子的模塊化4.6.1RNApolymerasetargets

RNA聚合酶的目標一開始是怎么知道的呢？α-amanitin/α鵝膏蕈堿RNApolymeraseIRNApolymeraseIIRNApolymeraseIIIrRNAprecursorHighconcentrationofα-amanitinRNApolymeraseIproducesrRNAprecursors.為什么α鵝膏蕈堿對人類有這么大的毒性？RNApolymeraseIRNApolymeraseIIRNApolymeraseIIIrRNAprecursortRNA,5SrRNA…Lowconcentrationofα-amanitinRNApolymeraseIIIproducestRNA,5SrRNAandothersnRNAs.為什么α鵝膏蕈堿對人類有這么大的毒性？ProductofRNApolymeraseII

RNA聚合酶II的產物NomRNARNApolymeraseIIdoesnotworkRNApolymeraseIIisresponsibleformakingmRNA.4.6.2ModularityofSpecificTranscriptionFactors

特異轉錄因子的模塊化Modularity:referstothecompositionofaproteinwithseparatestructuralmodules.模塊化：指蛋白質由不同的結構模塊組成。Modules:

Proteindomainsthatarefoundinmanyproteinsandarewellconservedinevolution.模塊：在許多蛋白質中存在并且在進化中相當保守的蛋白質域。特異轉錄因子通常是模塊化的，含有一個DNA結合模塊和一個分開的激活模塊。Q

→Areproteinmodulesexchange-able?蛋白質模塊可以互換嗎？4.6.2

ModularityofSpecificTranscriptionFactors

特異轉錄因子的模塊化Moduleexchange模塊交換模塊化轉錄和/或翻譯產物可以很容易地被檢測出來的基因Thereportergenes/報告基因Braincancermodels

HumanU-87-RFPgliomagrowinginbrainofnudemouse.腦瘤模型：生長在裸鼠腦中的人神經膠質瘤RFPGFP報告基因綠色熒光蛋白ThemodularityofGal4

(轉錄激活蛋白Gal4)模塊化upstreamactivationsequenceThemodularityofGal4

(轉錄激活蛋白Gal4)模塊化ThemodularityofGal4

(轉錄激活蛋白Gal4)模塊化YeastOneHybridSystem4.1真核生物RNA聚合酶4.2真核生物啟動子4.3通用轉錄因子與轉錄起始4.4特異轉錄因子與轉錄調控4.5特異轉錄因子的結構4.6實驗研究 主要內容4.5.2DNA-BindingMotifsineukaryote 真核生物DNA結合基序1.Homeodomain

同源異型域2.Zincfingermotif

鋅指基序3.Leucinezipper

亮氨酸拉鏈HLHmotif

螺旋-環-螺旋基序?EukaryoticThehomeodomain/同源異型域SimilartoHTHofprokaryotesHomeodomain:DNA-bindingdomainfoundinmanyeukaryoticproteinsthatareinvolvedinorganismaldevelopment.同源異形域：在許多真核生物中發現的DNA結合域，在生物發育中起作用。由短的肽鏈轉角連接在一起的三個α螺旋組成。其中兩個螺旋在一起看起來與HTH基序非常相似。Zincfingermotif/鋅指基序Zincfingers:DNAbindingdomainsthatareelongated,with