2.2.1動物細胞培養和核移植技術

2.2.2

動物細胞融合與單克隆抗體

一、動物細胞培養⒈定義：⒉流程：⒊條件：⒋應用：P47你知道嗎？人造皮膚未來可用于燒燙傷的植皮、糖尿病的傷口愈合等，極具治療價值。一片手術切下的1cm2大小的皮膚，經細胞培養，嬰兒的最多可以培養到5個足球場大的人造皮膚，成人的隨著年齡增大，培養的面積越小。三個問題：what?why?how?⒈什么是動物細胞培養？Goback⒉如何進行動物細胞培養？(流程）閱讀課本后回答相關問題:思考題1、植物組織培養過程將組織分散成單個細胞的嗎？２、動物細胞培養過程將組織分散成單個細胞的嗎？３、為何動物細胞培養過程要將組織分散成單個細胞？４、如何將動物組織分散成單個的細胞呢？５、胰蛋白酶的作用是什么呢？

由此可說明細胞間的物質是什么成份？沒有是成塊的組織細胞靠在一起,彼此限制了細胞的生長和增殖先用剪刀剪碎,后用蛋白酶處理水解蛋白質蛋白質６、細胞膜的主要成份是什么？蛋白質和磷脂７、胰蛋白酶能將細胞消化掉(指破壞)嗎？能思考題８、既然胰蛋白酶能將細胞消化掉，那將動物組織分散成單個細胞要注意什么問題呢？９、能夠用胃蛋白酶代替胰蛋白酶嗎？為什么？10、取材時,一般取胚胎組織或幼齡動物的組織或器官，請解釋原因？注意時間的控制不能，胃蛋白酶最適pH約為1-2，

而胰蛋白酶的與組織細胞的生存環境較接近分裂、增殖旺盛11、動物細胞培養瓶內表面為何要光滑、無毒？易于培養細胞貼壁，進行生長增殖表面相互接觸時，會停止分裂增殖，叫接觸抑制12、培養瓶中的細胞培養到什么時候就不再分裂、增殖？思考題13、如此時細胞數量并未達到人們的需求，應該怎樣辦？用胰蛋白酶處理，繼續分瓶培養增殖，稱為傳代培養14、如何理解原代培養和傳代培養？15、傳代培養的細胞能一直傳代下去嗎？16、有些為何能一直傳下去嗎？17、動物細胞培養就是為了得到這些細胞嗎？18、人類一般保存的是哪類細胞呢？為什么？將動物組織消化后的初次培養就是原代培養，發生接觸抑制后轉移到其它培養瓶中培養就是傳代培養不能發生突變，朝著癌細胞方向發展不是保存10代以內的細胞，因為10－50部分細胞的細胞核型可能發生變化，有少部分還發生突變向癌細胞方向發展⒉如何進行動物細胞培養？(流程）剪碎動物組織胰蛋白酶、膠原蛋白酶處理（分解彈性纖維、膠原纖維）細胞懸浮液酶處理并分瓶10代細胞原代培養傳代培養接觸抑制遺傳物質遺傳物質初次培養一般有貼壁生長和接觸抑制現象一般不變部分可能改變為何要定期用胰蛋白酶使細胞從瓶壁上脫離下來？50代細胞無限傳代失去接觸抑制遺傳物質改變傳代培養傳代培養Goback⒉如何進行動物細胞培養？(流程）剪碎動物組織胰蛋白酶、膠原蛋白酶處理（分解彈性纖維、膠原纖維）細胞懸浮液酶處理并分瓶10代細胞原代培養傳代培養接觸抑制遺傳物質遺傳物質初次培養一般有貼壁生長和接觸抑制現象一般不變部分可能改變50代細胞無限傳代失去接觸抑制遺傳物質改變傳代培養傳代培養Goback⑩動物組織先？再用？或？處理？加培養液細胞懸液轉入培養瓶，一般有？和？現象？培養？處理并分瓶10代細胞？培養,有？現象細胞核型？50代細胞？處理并分瓶？培養,有？現象細胞核型？？？培養,失去？現象細胞核型？營養物質理化性質無毒、無菌⒊條件：3.如何創造培養液的無毒無菌環境？⒊條件：（了解）培養液的成分：含有葡萄糖、氨基酸、無機鹽、有機鹽、維生素和動物血清等⑴⑵⑶動物細胞培養有什么用？海拉系癌細胞成纖維細胞培養上皮細胞培養

⑴⑵⑶⑷⑸培育自體細胞，避免免疫排斥許多致畸、致癌物質加入培養液后，培養細胞會發生染色體結構和數目的變異。根據變異細胞占全部培養細胞的百分數，可以判斷某種物質的毒性。生產、研究、醫用⑩⒉如何進行動物細胞培養？(流程）剪碎動物組織胰蛋白酶、膠原蛋白酶處理（分解彈性纖維、膠原纖維）細胞懸浮液酶處理并分瓶10代細胞原代培養傳代培養接觸抑制遺傳物質遺傳物質初次培養一般有貼壁生長和接觸抑制現象一般不變部分可能改變50代細胞無限傳代失去接觸抑制遺傳物質改變傳代培養傳代培養動物細胞培養需不需要脫分化？高度分化的細胞分裂能力會很差，不能用來培養，所以要脫分化。動物細胞的脫分化能力不如植物，所以即使脫分化效果也不好。因此在培養動物細胞的時候，所選取的組織是幼齡動物組織或者是胚胎組織，因為這樣的組織分化程度低，容易分裂。故目前階段的培養多數不用。(幼齡動物)植物組織培養與動物細胞培養的比較原理培養基結果目的植物組織培養動物細胞培養細胞的全能性固體;

營養物質，培育成植株快速繁殖，培育脫毒植株等細胞的增殖液體；

營養物質，培育出傳代的細胞獲得細胞或細胞的產物等激素動物血清二、動物體細胞核移植技術和克隆動物

1996年7月5日，克隆羊“多莉”誕生，引起世界的轟動，我國有人聲稱早在80年代初已有了克隆牛，難道在這方面我國技術領先世界了嗎？

1937年，美國科學家懷特首先用煙草莖作為材料在試管中培養了煙草植株。

1996年世界上第一只克隆羊多莉誕生。為何動物成功遲了近60年？思考1：思考2：能像植物組織培養一樣培養出動物個體嗎？克隆動物又是怎么得來的？思考3：二、動物體細胞核移植技術和克隆動物⒈動物細胞全能性的特點：P47⒉克隆及核移植定義與分類：P47⒊核移植過程：⒋應用前景：⒌存在問題：細胞全能性高低指：細胞→個體的容易程度Goback克隆羊——多莉供體細胞供體細胞培養卵巢次級卵母細胞無核卵母細胞重組細胞重組胚胎克隆動物去核、殺核取核注入電激

融合理、化法激活移植代孕取出、培養Goback⑴⑵⑶①②③⑤Goback核移植培養存在脫分化⑵⑶⑴⑷一般不需要高度分化的細胞分裂能力會很差，不能用來培養，所以要脫分化。動物細胞的脫分化能力不如植物，所以即使脫分化效果也不好。因此在培養動物細胞的時候，所選取的組織是幼齡動物組織或者是胚胎組織，因為這樣的組織分化程度低，容易分裂。目前培養的一般不需要。植物組織培養與動物細胞培養的比較原理培養基結果植物組織培養動物細胞培養①③(形態);

除營養物質外，培育成⑤②④(形態)；

除營養物質外，培育出⑥需額外添加(③)需額外添加(④)⑨基因型為AAbb和Aabb的兩個品種的花粉進行原生質體融合后，可產生

種基因型的融合細胞（僅考慮兩兩融合），這些基因型分別是

;這些融合細胞再經過組織培養可以得到

種不同于親本表現型的新品種。⑦⑧3AAbb

Aabb

aabb1下周一課堂測驗范圍：基因工程細胞工程生態工程周末帶練習冊回去看看！細胞融合可能是正常的生命活動一、動物細胞融合⒈概念：⒉方法：⒊意義：⒋與植物細胞融合比較二、單克隆抗體⒈制備：⒉優點：⒊應用：傳統抗體的獲得特異性強、靈敏度高、可大量制備單抗自身優點：作為診斷試劑：準確、高效、簡便、快速⒉方法：物理法化學法生物法方法喪失感染活性

（不感染細胞）保留融合活性

（誘導細胞融合）紫外線仙臺病毒2030505050Goback4.植物體細胞雜交與動物細胞融合的比較原理方法步驟誘導手段用途①細胞膜的流動性②細胞的全能性去除細胞壁后誘導原生質體融合物(離心、電刺激、振動)、化(聚乙二醇)等試劑誘導克服遠源雜交不親和，獲得雜交植株細胞膜的流動性使細胞分散后誘導細胞融合物、化同上，再加上生(滅活的病毒)誘導培育雜交細胞或獲得細胞產物(制備單克隆抗體)植物體細胞雜交動物細胞融合Goback思考：如何得到狂犬病抗體？漿細胞(產生抗體)癌細胞(無限繁殖)?無限繁殖且產生抗體?傳統抗體的獲得與缺點Goback⒈制備分離(能產生抗體)(無限增殖又產生抗體)特定抗原注入小鼠體內B淋巴細胞骨髓瘤細胞雜交瘤細胞細胞融合兩次篩選培養專一抗體陽性細胞注入小鼠腹腔體內培養體外培養培養基從腹水提取從培養液提取單克隆抗體(無限增殖)(效應)Goon可以不管此步驟再次克隆原因：①剛篩選得到細胞表現不穩定②可能含有多種細胞⒈制備分離(能產生抗體)(無限增殖又產生抗體)特定抗原注入小鼠體內B淋巴細胞骨髓瘤細胞雜交瘤細胞細胞融合兩次篩選培養專一抗體陽性細胞注入小鼠體內培養體外培養培養基從腹水提取從培養液提取單克隆抗體(無限增殖)(效應)Goon篩選培養基得到的專一陽性克隆可能含有不分泌抗體的細胞或有多株分泌抗體的細胞，且剛融合的細胞不穩定，一般再經三次克隆選擇后，才能達到100%陽性克隆

應用練習：

⑴已知細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。⑵人淋巴細胞有D和S兩條合成途徑，但一般不分裂⑶鼠骨髓瘤細胞沒有S途徑，但能不斷分裂增殖。將這兩種細胞在試管中混合，加聚乙二醇促融，獲得雜種細胞。問如何分離，原理是什么？B淋巴細胞骨髓瘤細胞B淋巴細胞(融合)骨髓瘤細胞(融合)雜交瘤細胞衰老、死亡加入氨基喋呤無S，阻斷DDNA不復制而死亡不能分裂有S，能分裂無限增殖B淋巴細胞骨髓瘤細胞融合Goback⒉優點：①特異性強②靈敏度高③可大量制備⒊應用:⑴診斷⑵治療

單克隆抗體與從生物血漿內直接分離得到的(多克隆)抗體相比較，有何優點？思考1：思考2：根據這些優點，可有什么應用？區分：單抗自身優點與診斷應用的優點！！！⒊應用:

⑴診斷⑵治療1.動物細胞融合最重要應用的是：

A.克服遠緣雜交不親和B.制備單克隆抗體

C.培育新品種D.生產雜種細胞2.單克隆抗體制備過程中，骨髓瘤細胞和B淋巴細胞誘導融合后，要用特定培養基篩選出雜交瘤細胞，在這種培養基上不能存活增殖的細胞是：①淋巴細胞②小鼠骨髓瘤細胞③B淋巴細胞自身融合細胞④小鼠骨髓瘤細胞自身融合細胞⑤雜交瘤細胞

A．②④B．①③⑤

C．①②③④

D．②③3.給小鼠注射特定抗原的目的是：BC產生相應的(特定的)漿細胞9.課堂練習：分離(能產生②)(無限增殖又產生抗體)特定①注入小鼠體內②細胞③細胞④細胞細胞融合⑤次⑥培養⑦

細胞注入小鼠⑧體內培養體外培養⑧從⑨中提取從⑨提取⑩抗體(特點：③)供體細胞⑦卵巢⑧無核卵母細胞重組細胞重組胚胎克隆動物去核、殺核⑨⑨理、化法激活⑩取出、培養分化細胞⑤培養基②培養基①(過程)③④(過程)⑥植株現有A和B兩個肉牛品種:(1)如果說要獲得一頭克隆牛,基本步驟是,從A品種牛體內取出體細胞進行

,再從中取出一個細胞(細胞核)注入B品種牛的

卵母細胞(此卵母細胞應發育到

),再通過

使兩細胞融合,融合后可用

或

方法激活受體細胞,使其完成細胞分裂和發育,最后形成胚胎,該胚胎被稱為

,將該胚胎移入代孕母牛的

中,通過培育可達目的.(2)上述過程中運用了動物細胞工程的哪些技術?

.(3)克隆牛的產生說明

具有全能性.由A、B兩品種雜交得到的牛與克隆牛相比，雜交牛細胞核的遺傳物質來自

個親本，克隆牛與雜交牛的遺傳物質組成

。細胞培養去核MⅡ中電刺激物理化學重組胚胎子宮動物細胞培養動物細胞核移植細胞核2不同植物組織培養與動物細胞培養的比較原理培養基結果植物組織培養動物細胞培養①③(形態);

除營養物質外，培育成⑤②④(形態)；

除營養物質外，培育出⑥需額外添加(③)需額外添加(④)⑨基因型為AAbb和Aabb的兩個品種的花粉進行原生質體融合后，可產生

種基因型的融合細胞（僅考慮兩兩融合），這些基因型分別是

;這些融合細胞再經過組織培養可以得到

種不同于親本表現型的新品種。⑦⑧3AAbb

Aabb

aabb12009—2010學年度高二上學期寒假作業（理科生物）38.基因工程可以用于治療動物及人的單基因遺傳病，從基因治療的概念分析，它治療的遺傳病為A．伴性遺傳病

Ｂ．常染色體遺傳病C．顯性遺傳病

D．隱性遺傳病39.科學家用納米技術制造出一種“生物導彈”，可以攜帶DNA分子。把它注射入組織中，可以通過細胞的內吞作用的方式進入細胞內，DNA被釋放出來，進入到細胞核內，最終整合到細胞染色體中，成為細胞基因組的一部分，DNA整合到細胞染色體中的過程，屬于

A．基因突變

B．基因重組

C．基因互換

D．染色體變異42.科學家通過基因工程的方法，將血清白蛋白基因導入動物細胞，并通過動物分泌的乳汁來生產血清白蛋白。以下有關基因工程的敘述，錯誤的是（

）A．采用反轉錄的方法得到的目的基因與天然存在的目的基因完全一樣B．基因工程能定向地改變生物的遺傳性狀

C．將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法D．用同一種限制酶，分別處理質粒和含目的基因DNA，可產生相同黏性末端而形成重組DNA分子43下表為幾種限制性核酸內切酶識別的序列和切割的位點。如下圖，已知某DNA在目的基因的兩端1、2、3、4四處有BamHⅠ或EcoRⅠ或PstⅠ的酶切位點。現用BamHⅠ和EcoRⅠ兩種酶同時切割該DNA片段（假設所用的酶均可將識別位點完全切開），下列各種酶切位點情況中，可以防止酶切后單個含目的基因的DNA片段自身連接成環狀的是:A．1為BamHⅠ，2為EcoRⅠ，3為BamHⅠ，4為PstⅠB．1為EcoRⅠ，2為BamHⅠ，3為BamHⅠ，4為PstⅠC．1為PstⅠ，2為EcoRⅠ，3為EcoRⅠ，4為BamHⅠD．1為BamHⅠ，2為EcoRⅠ，3為PstⅠ，4為EcoRⅠ44．下圖示一項重要生物技術的關鍵步驟，字母X可能代表

A．不能合成胰島素的細菌細胞；

B．能合成胰島素的人類細胞；C．能合成胰島素的細菌細胞；

D．不能合成抗生素的人類細胞1．在動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較中，正確的是（）

A．結果是相同的

B．雜種細胞的形成過程基本相同

C．操作過程中酶的作用相同

D．誘導融合的手段相同Ｂ2．胚狀體是在植物組織培養的哪一階段上獲得的（）

A．愈傷組織B．再分化

C．形成完整植株D．取離體組織B課堂練習材料3：植物細胞①植物細胞②③④雜種細胞細胞分裂。。。。據材料分析：1、“改造后的卵細胞”的分裂是

分裂。2、“胚胎的基因與體細胞提供者的基因絕大部分是相同的”。那么“不相同的基因”控制的性狀遺傳方式屬

遺傳

3、寫出以下過程或結構的名稱A

B

C

④

。

4、名貴花卉進行離體培養時不應采用該株的：A、莖尖B、子房壁C、花粉粒D、葉片

植物體植物的器官、組織或細胞培養基中培養BAC再分化材料2：有絲細胞質脫分化愈傷組織胚狀體原生質體C3.材料1：利用體細胞核移植技術改造后的卵細胞可以克隆出有關動物，如多利羊4、動物細胞工程技術的基礎是------（）

A.動物細胞融合B.單克隆抗體

C.胚胎移植D.動物細胞培養D5、用于動物細胞培養的組織和細胞大都取自胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織，其主要原因是這樣的組織細胞（）

A.容易產生各種變異B具有更強的全能性

C.取材十分方便D分裂增殖的能力強6、下列屬于動物細胞工程中的工具是（）

A．限制性內切酶B．DNA連接酶

C．胰蛋白酶D．果膠酶DC7、下列與動物細胞培養有關的表述中，不正確的是A．培養液通常含有葡萄糖、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清B．原代培養的細胞一般傳至10代左右便會出現生長停滯C