第四章微生物的生長一、微生物的生長二、微生物生長的測定方法第一節微生物生長的測定

單細胞微生物也有個體生長和細胞分裂繁殖這兩個過程。多細胞微生物的個體生長則反映在個體的細胞數目和每個細胞內物質含量的增加。

在實際工作中，單個微生物細胞太小，研究單個微生物細胞的生長比較困難，并且也無意義。

微生物的生長是指微生物個體或群體細胞各組成成分按比例、有規律地不可逆增加的過程。微生物的生長表現在微生物個體的生長和群體生長2個水平。一、微生物的生長個體生長

個體繁殖

群體生長群體生長=

個體生長

+

個體繁殖

所以，微生物的生長通常是指微生物的群體生長！！也就是說：微生物的生長過程包含了微生物的繁殖過程。

在實際工作中，測定微生物細胞生長的方法可以分為兩類。生長的

測定方法

細胞計數法細胞生物量的測定

直接計數法計數器測定法平板菌落計數法

比濁法最大概率數法

間接計數法涂片計數法細胞的自動計數法干重法含氮量測定法（一）、細胞計數法

鏡檢計數法適用于單細胞微生物數量的測定。測定時需借助計數板和顯微鏡。

細胞較小的細菌可采用比得羅夫—霍瑟細菌計數板，細胞較大的酵母菌、真菌孢子和血細胞則采用血球計數板。1、直接計數法（1）計數器測定法快速簡便，但不能區別死活菌體，測得的是總菌數。利用直接計數法測定微生物細胞數量時，菌懸液濃度不宜太低或太高（常大于106個/ml）。（2）涂片計數法將已知體積的待測樣品，均勻的涂布在載玻片的已知面積內，經固定染色后，在顯微鏡下選擇若干個視野計算細胞數量。

每個視野可用鏡臺測微尺測量直徑并計算面積，從而推算出單位體積樣品中所含的細胞數量。（3）細胞的自動計數法用電子細胞計數器來計數。電子計數是通過測定一個小孔中液體的電阻來進行。小孔僅能通過一個細胞，當細胞通過這個小孔時，電阻明顯增加，并作為一個脈沖記錄在一個電子標尺上。使一份已知體積含有待測細胞的液體通過這個小孔，當每個細胞通過時就被計數了。2、間接計數法（1）平板菌落計數法

將待測液按10倍遞增做一系列稀釋，然后選擇其中某連續三個稀釋度的菌液作涂布平板或傾注平板，在一定的條件下培養，那么分散的每一個細胞都將發育成一個菌落，再對平皿中菌落計數就可以推算出原始樣液中的活菌數。測得的是活菌數，手續繁雜，容易受影響

該方法主要是依據在適當的稀釋度下，每一個微生物細胞可以繁殖成一個菌落，通過測定菌落的數量即可來推算菌懸液中的活菌數。優點：測定的是活菌數。缺點：操作煩瑣，時間長N=每套平板的平均菌落數×稀釋倍數÷取樣體積數（2）最大概率數法

將一定量的稀釋液接種到新鮮合適的培養基上以后不出現繁殖為止。再選擇三個連續稀釋度作試管培養，根據出現生長的管數，查找已編好的MPN（最大概率表），就可以計算出單位體積樣品中細胞的近似數。（1）比濁法

是一種快速測定菌懸液中微生物細胞數量的方法。當光線通過菌懸液時，由于菌體細胞不能透光，會造成透光率下降。在一定的濃度范圍內，微生物細胞濃度與菌懸液的光密度（OD值）成正比，與透光度成反比。因此，可預先測定菌液濃度與OD值之間的關系曲線，然后可據此查得未知樣品中菌的相對數量。（二）測定細胞或原生質總量的方法此法簡單快速，但顏色不能太深，不能含有顆粒性雜質。2、干重法

取一定量的菌液，用離心或過濾的方法將菌體分離出來，清洗后置于80~100℃烘箱中烘干至恒重或在60℃真空干燥至恒重后稱其重量。一般細菌干重約為濕重的20%~25%。

適用于含菌量高但不含其他溶性雜質的樣品。蛋白質是細胞的主要組分，氮又是蛋白質的重要組分，且氮的含量是相對穩定的，因此，可以借菌體含氮量來間接表示菌體的含量。

3、總氮量測定法

適用于菌體濃度較高的樣品，一般只適合研究工作。第二節細菌的生長曲線一、單細胞微生物的生長曲線二、掌握微生物生長規律對工業生產的指導意義一、單細胞微生物的生長曲線

細菌細胞雖小，但與其他生物細胞或個體一樣，也有從小到大的生長過程。

將少量的細菌純培養物接種到恒定體積的液體培養基后，定時取樣測定培養基中的細胞數量，可以發現細菌的群體生長具有一定的規律。

若以時間作橫坐標，以活菌數的對數值作縱坐標，可以繪制出一條類似于S型的曲線，稱為細菌的生長曲線。

緩慢期對數期穩定期衰亡期t0lgN1、緩慢期（延遲期）

當細菌接種到新鮮的培養基后，細菌往往不會立即繁殖，需要經過一定時間來調節自身的生理機能，以適應新環境。因此，在曲線開始的一段時間，細胞數量幾乎不增加，生長速率趨近于零，曲線平緩。特點：這個時期的長短與菌種的遺傳性、菌齡、接種菌量、培養條件等因素有關。緩慢期對數期穩定期衰亡期t0lgN2、對數期（指數期）

細菌在完全適應新環境后，細胞開始轉入旺盛生長，生長速率達到最大值，細胞呈幾何級數（2n）增加，進入對數期。特點：對數期，培養條件相同時，不同菌種的代時（即繁殖一代所需要的時間）是不相同的，相同菌種的代時則是穩定的；培養條件不同時，同一菌種的代時也是不同的。此外，對數期的菌體整齊、代謝活躍、生長快、染色均勻，群體中的細胞化學組成、形態、生理特征比較一致。緩慢期對數期穩定期衰亡期t0lgN3、穩定期（平衡期）

在對數期以后，由于營養物質逐漸消耗，有害代謝產物積累，pH值變化等，使細胞生活力下降，細胞的繁殖速率開始下降，而死亡率上升，當二者趨于平衡時，群體的活菌數達到最高并保持一段時間的相對穩定。特點：處于穩定器的菌體形態大小典型，生理生化反應相對穩定，細胞開始積累貯存物質，如肝糖、異染顆粒、脂肪粒等，大多數芽孢菌在這個生長階段形成芽孢。抗生素和某些酶類也在對數期和穩定期轉換階段產生。

緩慢期對數期穩定期衰亡期t0lgN4、衰亡期穩定期后如果繼續培養，菌體就會出現變形、自溶等現象，死亡率逐漸增加，活菌數迅速減少，這一階段稱為衰亡期。二、掌握微生物生長規律對工業生產的指導意義（一）縮短緩慢期（二）延長對數期（三）控制穩定期（四）推遲衰亡期

微生物生長是微生物自身的遺傳特性和外界環境因素共同作用的結果。在一定限度內，環境因子的變化，可導致微生物的形態、生理或遺傳特性的變化，但如果環境因子的改變超過了一定限度，則會造成微生物細胞的死亡。當然，微生物也可在一定程度上通過自身的代謝活動來改變環境條件，使之更適應其生存和發展。

影響微生物生長的環境因素較多，概括起來有三大類，包括物理、化學和生物因素。第三節微生物生存環境條件環境因素溫度

水分和滲透壓

pH值

氧氣和Eh

輻射線

超聲波

化學藥劑

物理因素化學因素生物因素一、溫度

溫度是微生物生長的重要環境條件之一，不同微生物的生長繁殖都需要一定的溫度范圍，表現為最低、最適和最高生長溫度（即溫度三基點）。

1、微生物的生長溫度范圍

根據微生物對溫度的要求和適應能力，可將其分為嗜冷、嗜溫和嗜熱微生物三種類型：微生物類型最低(℃)最適(℃)最高(℃)生活環境嗜冷

微生物

專性

-12

5—15

15—20生活于兩極地區

兼性

-5—0

10—20

25—30

海水及冷藏食品

嗜溫

微生物

室溫

10—20

25—3040—45

土壤中、植物體內等環境體溫

10—20

37—40

40—45

人及溫血動物體內等環境嗜熱

微生物

專性25—45

50—5570—90生活于堆肥、溫泉、土壤表層等高溫環境中

2、溫度對微生物的作用

（1）最低生長溫度對微生物的影響

最低生長溫度是微生物生長的溫度下限，低于此溫度，微生物的生長就會受到抑制，但一般不會死亡。因此，可以利用低溫來保藏微生物或者保藏食物，常用的保藏溫度為4-8℃。

從最低生長溫度到最適生長溫度，隨著溫度的上升，細胞的代謝活性增強，生長速率加快。

（2）最適生長溫度對微生物的影響

最適生長溫度是微生物生長速度最快的溫度，但并非微生物代謝的最適溫度。

如：乳鏈球菌最適生長溫度是34℃，細胞總量最高的溫度是25-30℃，而發酵速度最快溫度則為40℃，乳酸產量的最高溫度是30℃。

（3）最高生長溫度對微生物的影響

微生物在最高溫度下僅有微弱生長，而當環境溫度超過微生物生長的最高溫度后，將導致微生物細胞結構的不可逆破壞，蛋白質、酶、核酸變性，最終將殺死微生物。

通常將能在10分鐘內殺死微生物的溫度稱為致死溫度。

高溫可以導致微生物細胞死亡，因此，可以利用高溫來滅菌。

多數細菌、酵母菌、真菌和病毒的致死溫度為55-60℃；放線菌和真菌的孢子抗熱性比其營養細胞強，在75-80℃時，10分鐘才會被殺死；細菌的芽孢具有高度的耐熱性，可以耐受100℃的高溫；極少數細菌，如嗜熱脂肪芽孢桿菌在70℃下可以生長，芽孢在121℃加熱12分鐘才會死亡。致死溫度：3、高溫滅菌的方法

干熱滅菌

濕熱滅菌

焚燒

恒溫干燥法

（耐熱的金屬和玻璃器皿、可燃燒的物品）

（常用，140-160℃，2h；耐熱的物品）

煮沸

巴斯德消毒法間歇滅菌

高壓蒸汽滅菌

超高溫滅菌（100℃，15min以上；不耐熱的物品）

（常用，0.2Mpa，121℃，20min；一般培養基、水、纖維制品）

（0.05MPa，110℃，20min；含糖培養基）

（60-70℃，15-20min；食品、飲料等）（100℃，每次2-3h，2-3次；不耐高溫的藥品，特殊培養基）

（130—140℃，0.5—1s，液體的飲料等）

二、水分和滲透壓

微生物細胞的含水量一般為70-90%，孢子或芽孢的含水量較低，只有60-70%。水分是微生物細胞代謝活動必不可少的條件，如果外界環境過于干燥，將影響微生物的正常代謝，甚至會造成細胞死亡。

當環境中缺水或大氣相對濕度低于70%時，微生物細胞的生長會受到抑制。因此，可以借用干燥的方法來保存食品和物品。

除缺水會直接影響微生物的生長外，當環境中滲透壓發生改變時，也可能導致細胞發生生理性缺水，使細胞不能進行正常的生長代謝。因此，可用蜜餞或鹽漬的方法保存食品。

超聲波是指振動頻率超過2萬Hz的聲波。通過劇烈的振動，使細胞破裂，引起細胞內含物外泄死亡。

超聲波的破碎效果與處理功率、頻率、處理時間、微生物類型和生理狀態等因素有關。

在研究工作中，常用超聲波來破碎細胞。但超聲波處理時會釋放大量的熱能，所以，必須在冰浴中進行，并作短時間的多次處理。三、超聲波(一)pH值

環境的pH值對微生物的生長有較大的影響。微生物可在pH1-11的范圍內生活，但不同的微生物對pH值的適應性有較大的差異。大多數細菌、放線菌的最適pH值為7.0-8.0，適應范圍5.0-10.0，真菌的最適pH值多為3.0-6.0。

pH值的改變常造成微生物代謝途徑的改變，并形成不同的代謝產物。

微生物也可以通過自身的代謝活動改變環境的pH值，因此控制發酵液的pH是控制生產的指標之一。常用方法：加入緩沖物質、適時加無機酸堿或生理活性物質等。應用pH的殺菌：強酸、強堿具有很強的殺菌力，但無機酸堿對人和器皿的腐蝕性強，故很少采用。乳酸、醋酸等有機酸對環境危害小，可用作防腐劑。石灰常用于環境衛生的消毒。

（二）氧氣

氧氣對微生物生長的影響也較大。

不同的微生物對氧氣的需求不同，根據微生物對氧氣的要求，可以將微生物分為五大類：好氧微生物

厭氧微生物

兼性厭氧微生物

微好氧微生物

耐/忌氧微生物

微生物極少單獨存在，總是較多種群聚集在一起，當微生物的不同種類或微生物與其他生物出現在一個限定的空間內，他們見互為環境，表現出復雜的關系：（一）寄生（二）互生（三）共生（四）拮抗三、生物因素對微生物生長的影響二、化學消毒劑

不同的化學藥劑對微生物生長的影響是不同的。大多數化學藥劑只有在高濃度時才起殺菌作用，低濃度僅為抑菌作用，而極低濃度則沒有作用或對微生物的生長有促進作用。

化學藥劑對微生物的作用取決于藥劑濃度、作用時間和微生物對藥物的敏感性等。研究表明化學藥劑對微生物的作用主要表現為三方面：（1）破壞細胞結構，如苯酚、乙醇。（2）干擾細胞能量代謝，如重金屬、CO和氰化物。（3）干擾物質合成，如磺胺、氨基酸結構類似物。

根據化學藥劑的性質和使用目的，可分為五種類型：

有機化學藥劑無機化學藥劑染色劑表面活性劑

化學治療劑三、紫外線和射線

在環境中存在著各種能量的輻射線，不同能量的輻射線對微生物生長的影響不相同的。可見光波長397-800nm，是光能自養型和光能異養型微生物唯一的或主要的能量來源。1、紫外線（UV）

紫外線是波長為100-397nm的非電離輻射線，具有較強的殺菌和誘變作用，其最強的作用波長是265-266nm，這也是微生物細胞核酸的最大吸收波長。

紫外線主要作用于細胞DNA，使相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體、使DNA斷裂或發生交聯，最終使微生物細胞變異或死亡。另外還可促使氧形成臭氧。

通常低劑量的UV可用于誘變育種，而高劑量的UV可殺菌，但其穿透力較弱，一般僅用作空氣、無色的水和器皿表面的滅菌。1.SPF值：一般類型皮膚的人8～12為宜；對光敏感的人12－20為宜；敏感性皮膚應挑選植物配方的防曬品或是含有二氧化鈦的物理性防曬霜；只在上下班的路上接觸陽光的上班族，15以下即可，以臉部防曬為主；在野外游玩、海濱游泳時30以上。游泳時最好選用防水的防曬護膚品。2.PA值：PA+有效防護時間大約4小時。PA++有效防護時間大約8小時。PA+++超強防護。2、電離輻射

電離輻射是高能電磁波，包括X-射線、α-射線、β-射線和γ-射線。這些射線的特點是波長短，能量大，穿透力強，殺傷力大。對微生物有致死作用。常用的高能射線是利用60Co源產生的γ-射線。可用于不耐熱食品、塑料制品和草炭吸附劑的滅菌。激光有強烈殺菌能力的波長是在250~800nm間，特別是265nm波長最有效。微波是頻率在3×102~3×105MHz的電磁波。3、激光與微波四、接種室的空氣滅菌五、過濾除菌六、防霉劑1、有機化學藥劑（1）酚及其衍生物

酚類化合物是醫學上常用的消毒劑，其作用主要是損傷微生物的細胞膜，鈍化酶和使蛋白質變性。苯酚的有效殺菌濃度為2-5%，但因具有難聞的氣味和對皮膚的強烈刺激性，很少在臨床上使用。甲酚、間苯二酚等苯酚衍生物的刺激性小，殺菌作用較強，常用于醫院對痰液、糞便及手術前的消毒。煤皂酚（來蘇爾）是乳化的甲酚溶液，常用3-5%的煤皂酚來消毒桌面、用具等。

（2）醇類

可通過細胞膜中的類脂而破壞膜結構，并使蛋白質變性，但對芽孢和無囊膜病毒的作用效果較差。70%的乙醇殺菌力最強，常用于皮膚的消毒。加入1%的碘可使其殺菌力大大的增強。異丙醇的殺菌力較乙醇強，揮發性低，常用于皮膚和用具的消毒。

（3）醛類

醛可與蛋白質的多種基團發生共價結合而使之變性。37-40%的甲醛溶液俗稱福爾馬林，常用于保存生物標本。實驗室用0.5-10%的甲醛溶液，加熱熏蒸進行空氣消毒。其缺點是對眼睛和粘膜具有刺激性，穿透力較差，作用慢，氣味難聞。戊二醛的刺激性和異味均較小，殺菌力強，在3-10h內可殺死細菌芽孢，常用2%戊二醛消毒醫療器械和用具。

（4）酸類

有機酸能抑制微生物酶和代謝活性，對人毒性小，常加入食品、飲料和化妝品中，以防止霉菌生長。山梨酸鉀，苯甲酸鈉等常用于食品防腐。

可用5~10ml/m2的醋酸來熏蒸滅菌，所以釀醋的工人很少感冒。（5）新型有機化學殺菌劑

環氧乙烷是目前廣泛應用的一種新型空氣和器械表面消毒劑，可使蛋白質變性，能在4~18小時內殺死微生物細胞和芽孢，常用于不耐熱物品的消毒，但缺點是毒性大、純品易爆，使用時需與CO2和N2混合使用。

2、無機化學藥劑

主要包括鹵化物、重金屬、氧化劑、無機酸和堿等。

常用碘和氯。（1）鹵化物碘可與酶或蛋白中的酪氨酸結合，對各類都有較好的殺菌作用。碘酒可用于皮膚、傷口和粘膜表面的消毒。氯包括氯氣和氯化物，可用作飲水、游泳池、垃圾場器具的消毒。氯氣和氯化物的殺菌作用在于產生次氯酸和原子氧，初生態的原子氧是強氧化劑，能破壞細胞膜，殺死微生物。

（2）重金屬及其化合物

重金屬離子具有很強的殺菌效力，以Hg+、Ag+和Cu2+的作用最強。重金屬離子進入細胞后可與酶和蛋白質上的巰基（-SH）結合，使之失活或變性。汞的化合物中常用的是0.1%的升汞（氯化汞）和有機汞，如紅汞、硫柳汞等。由于無機汞毒性較大，并具有殘留毒性，因此無機汞化物只用于種子表皮和器皿表面的消毒。有機汞毒性較小，可用于傷口和皮膚表面的消毒。銀的化合物以硝酸銀應用較多，0.1~1%的濃度可用作滴眼劑和皮膚消毒劑。銅的化合物使用最多的是硫酸銅，一般用1ppm的硫酸銅防止藻類在清潔水體中生長。波爾多液是硫酸銅與生石灰（CaO）的混合液，可用于防治農作物的真菌病害。

（3）氧化劑

氧化劑主要通過對細胞成分的氧化作用來達到殺菌的目的。常用的有0.1%的高錳酸鉀和3%的過氧化氫。臭氧的氧化性非常強，可用于飲水的消毒，但目前的成本比較高。

3、染色劑

許多生物染色劑在低濃度下具有明顯的抑菌效果和一定的特異性。堿性染料的陽離子基團可與蛋白質氨基酸上的羧基或核酸上的磷酸基團結合，從而阻斷正常細胞的代謝過程。

常用的有結晶紫、吖啶黃等堿性染料。G+細菌對堿性染料十分敏感，結晶紫在3~10ppm即可抑制G+細菌的生長，而對G-細菌的抑制濃度達到100ppm。

4、表面活性劑

表面活性劑是指可降低液體分子表面張力的化學物質，如肥皂、洗衣粉等。表面活性劑能夠影響細胞膜的穩定性和透性，使細胞的某些必要成分（如K+）流失而引起微生物生長停滯并死亡。肥皂和洗衣粉等陰離子表面活性劑的殺菌力不強，主要通過洗滌來減少微生物的數量。季胺類陽離子表面活性劑具有