培養基和滅菌第一頁，共五十六頁，2022年，8月28日第一節培養基成分及其功能碳源、氮源、無機鹽、微量元素、水、生長因子、前體、誘導劑或刺激劑、抑制劑例：高氏培養基（培養放線菌）：

可溶性淀粉2克，硝酸鉀0.1克，磷酸氫二鉀0.05克，氯化鈉0.05克，硫酸鎂0.05克，硫酸亞鐵0.001克，瓊脂2克，水100毫升。第二頁，共五十六頁，2022年，8月28日一、碳源：提供微生物生長繁殖所需的能源，構成細胞和抗生素的碳骨架。1．碳水化合物：單糖（葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖），二糖（麥芽糖、乳糖），多糖（蔗糖、淀粉、糊精等）

2．脂肪：油（脂肪）水解脂肪酶

甘油（脂肪酸）溶解氧C02+H20

第三頁，共五十六頁，2022年，8月28日3．有機酸有機酸或它們的鹽也能作為微生物的碳源。注意！有機酸的利用常會使pH上升。

CH3COONa+O2→2CO2+H2O+NaOH第四頁，共五十六頁，2022年，8月28日葡萄糖是最容易被吸收利用的碳源，幾乎所有微生物都可以利用葡萄糖，葡萄糖可以加速微生物的生長，但葡萄糖濃度過高，反而對生長、產抗生素不利。淀粉、糊精等也是常用的碳源，一般經胞外酶水解成單糖后被吸收利用。第五頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、氮源：主要用于構成菌體細胞物質，如氨基酸、蛋白質、核酸等和含氮的目的產物如青霉素、鏈霉素等抗生素。1、無機氮源（快速利用N源）：銨鹽（如氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、磷酸銨），硝酸鹽（如硝酸鈉、硝酸鉀）和氨水等。特點：（1）分解快，能被微生物迅速利用；（2）引起pH變化。

(NH4)2S04→2NH3+H2S04生理酸性物質

NaNO3+4H2→NH3+2H20+NaOH生理堿性物質第六頁，共五十六頁，2022年，8月28日2、有機氮源（慢速利用氮源，多為天然有機物）：花生餅粉，黃豆餅粉，玉米漿，玉米蛋白粉，蛋白胨，酵母膏。在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌體吸收后再進一步分解代謝．最終用于合成菌體細胞物質和含氮的目的產物。第七頁，共五十六頁，2022年，8月28日三、無機鹽、微量元素：

微生物在生長繁殖和合成目的產物的過程中，需要某些無機鹽和微量元素作為其生理活性物質的組成或代謝的調節物，為微生物提供除C、N源外的各種重要元素。P、S（可構成細胞物質）Mg、Fe（可作為酶的組成成分或維持酶活性）K、Na（調節細胞滲透壓）Cu、Zn、Mn（作為酶的輔基和激活劑）第八頁，共五十六頁，2022年，8月28日四、水：

（1）構成生物體的成分；（2）培養基的組成部分；（3）參與代謝反應；（4）作為代謝反應介質；（5）作為物質傳遞介質；（6）良好的熱導體。第九頁，共五十六頁，2022年，8月28日五、生長因子：生長因子：有些微生物即使在具有合適的水分、碳源、氮源、無機鹽等的條件下，還不能生長或生長不好，但如果加入少量微生物生長所必需的有機物質，則生長良好。通常把那些對微生物生長不可缺少的微量有機物質，微生物不能通過普通的碳源、氮源合成這些物質，需另外添加的營養物質稱為生長因子。1．維生素：是輔酶的組成成分；2．氨基酸：有些生物不能合成某種氨基酸；3．嘌呤和嘧啶：構成核酸和輔酶。第十頁，共五十六頁，2022年，8月28日六、前體

在微生物合成抗生素過程中，有些化合物能被微生物直接利用來構成抗生素分子結構的一部分，而化合物本身的結構沒有大的變化，這些物質稱為抗生素的前體。第十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日七、誘導物或刺激劑：

所謂誘導物是指一些具有調節抗生素生物合成能力的小分子物質，它們是既不是營養物質又不是前體卻能提高產物產量的添加劑。如：β－吲哚乙酸是金霉素生物合成的刺激物；甲硫氨酸和亮氨酸是頭孢菌素的刺激劑。第十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日八、抑制劑：抑制劑是指在發酵過程中會抑制某些代謝途徑的進行，同時會使另一代謝途徑活躍，從而獲得人們所需的某種產物或是正常代謝的某一代謝中間產物積累起來。如加入二乙基巴比妥鹽可抑制利福霉素B以外其他利福霉素的生成，從而增加利福霉素B的含量和產量。第十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二節培養基的種類

一、按來源分類：1、合成培養基（1）所用原料的化學成分明確、穩定；（2）實驗重現性好、低泡；（3）適用于研究菌種基本代謝和過程的物質變化；（4）營養單一，價格昂貴，不適用于大規模工業生產。第十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日2、天然培養基（天然的動植物產品）（1）營養豐富，適合于微生物的生長繁殖和目的產物的合成。（2）組成培養基的原料來源豐富，價格低廉，適用于工業生產。（3）組分復雜，不易重復，若對原料質量等方面不加控制會嚴重影響生產的穩定性。LB培養基：1g酵母粉，0.5g蛋白胨，1gNaCl，100mLH2O第十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、按狀態分類：

固體培養基：適用于菌種的培養和保存；半固體培養基：（瓊脂用量為0.5～0.8％）主要用于鑒定菌種、觀察細菌運動特征及噬菌體的效價測定等；液體培養基：（水80％～90％），是發酵工業大規模使用的培養基，它有利于氧和物質的傳遞。

第十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日三、按用途分類：

1．孢子培養基供菌種繁殖孢子的固體培養基。能使菌體迅速生長，產生較多優質孢子并不易引起菌種發生變異。例如：高氏培養基第十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日2．種子培養基指一、二級種子罐的培養基和搖瓶培養基。主要含有容易被利用的碳源、氮源、無機鹽等，使孢子很快發芽、生長以及大量繁殖菌絲體，并使菌體長得粗壯和使各種有關的初級代謝酶的活力提高。赤霉素產生菌種子培養基：葡萄糖1.5%,糊精1.0%,花生粉1.5%,MgSO4·7H2O0.1%,KH2PO40.1%,消泡劑0.2%第十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日3．發酵培養基發酵培養基可供菌種生長、繁殖和合成產物。發酵培養基的組成除有菌體生長所必需的元素和化合物外，還要有產物所需的特定元素、前體和促進劑等。玉米淀粉7.0％，飴糖2.5％，豆餅粉0.3％，花生粉1.0％，MgSO4·7H2O0.07％，KH2PO40.14％，消沫劑0.05％，α-淀粉酶0.05％第十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日第三節影響培養基質量的因素

一、原材料質量的影響：玉米漿、黃豆粉、花生餅粉、蛋白胨、淀粉、糊精品種、產地、加工方法、儲藏條件

第二十頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、水質的影響地質（地區）（地貌）、季節、處理方法（漂白粉、沉淀劑、消毒劑）和環境水源質量的主要考慮參數包括pH、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質組成和含量。

第二十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日三、滅菌操作滅菌操作不當不僅會減少培養基中有效的營養成分，還會產生一些有毒物質，給發酵帶來不利的影響。蛋白質在高溫下變性，維生素在高溫下失活葡萄糖與含氨基的物質反應形成5-羥甲基糖醛和棕色的類黑精（焦化），對微生物有一定的毒性第二十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日四、培養基粘度的影響粘度是培養基物性的重要指標之一，它直接影響氧的傳遞、營養成分、無機鹽、生長因子等的擴散，從而影響細胞的呼吸、營養成分的吸收，最終導致影響目標產物的形成。“稀配方”：（1）中間補料；（2）精料發酵、基礎原料液體化；（3）補加無菌水第二十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日第四節培養基配置的原則

一、碳氮源種類的確定原則快速利用碳氮源、慢速利用碳氮源的種類、配比要滿足不同微生物，不同生長階段和生產階段的需要。例：頂頭孢霉（頭孢菌素c），葡萄糖有利于菌體生長，而半乳糖對抗生素生產有利。

第二十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、碳氮源比例的確定原則

1、氮源過多，會使菌體生長過于旺盛，pH偏高，不利于代謝產物的積累；氮源不足，則菌體繁殖量少，從而影響產量。2、碳源過多，則容易形成較低的pH；若碳源不足，則易引起菌體衰老和自溶。3、碳氮比不當還會影響菌體按比例地吸收營養物質，直接影響菌體的生長和產物的形成。4、C/N比等應與環境因素結合考慮。第二十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日三、培養基配置與pH之關系原則酸性抗生素發酵環境一般呈酸性（pH<7），中性及堿性抗生素發酵環境一般呈中堿性（pH>=7）。配置培養基時，生理酸堿性原料應合理搭配。第二十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日四、保證源副材料質量的穩定性原則培養基中各組分質量的穩定性是獲得連續、高產的關鍵。定點采購、定點加工、穩定加工工藝、恒定的貯存條件、預試驗。第二十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日第五章思考題1、培養基在抗生素發酵中的作用如何？2、培養基的種類及其特點是什么？3、培養基的成分及其在抗生素發酵中的功用是什么？4、影響培養基質量的因素有哪些？5、培養基配制的原則？第二十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日第六章

滅菌及染菌防治

染菌對抗生素生產過程的危害：（1）消耗培養基的營養成分；（2）使培養條件如溶氧、粘度發生變化；（3）有的雜菌會分泌一些對抗生素產生菌有毒或能使抗生素降解失活的物質，從而造成抗生素產量大幅度下降；（4）影響后道工序的正常生產、影響產品外觀及內在質量；（5）如果污染了噬菌體，不僅引起產生菌自溶，而且還會迅速大面積蔓延，嚴重威脅抗生素的生產。第二十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日第一節滅菌的理論和技術滅菌是指用化學或物理的方法殺滅或去除物料及設備中所有生命有機體的過程。一、物理滅菌射線滅菌熱滅菌（濕熱和干熱）過濾除菌第三十頁，共五十六頁，2022年，8月28日

（一）射線滅菌1、方法：通常用紫外線、高能量的電磁波或粒子輻射滅菌。其中以紫外線最常用。2、原理：紫外線的作用光譜與細菌體內核酸的吸收光譜相一致，DNA鏈上核苷酸的堿基因此具有強烈的吸收紫外線的能力，引起DNA結構形式的變化而導致死亡。3、特點：紫外線對芽孢和營養細胞都能起作用，但其穿透力極低，只能用于表面滅菌。對真菌孢子的殺滅能力不大。主要用來進行一定空間內空氣的滅菌（如無菌室等）。第三十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日（二）干熱滅菌

1、方法：包括火焰滅菌和熱空氣滅菌，常用的干熱空氣滅菌是利用電熱或者紅外線在一定設備內對各種用具物品進行殺菌。生產上常用的干熱滅菌的條件是160℃，時間1－2h。2、原理：高溫時微生物各種與溫度有關的氧化過程速率增快。3、特點：時間長、耗熱量大，應用不廣。一般用于滅菌后要求保持干燥狀態的物料。第三十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日（三）濕熱滅菌1、方法：直接用加壓濕蒸汽進行物料或設備容器的滅菌。用蒸汽將物料升溫到115－140℃保持一定時間，可殺死各種微生物。常用的滅菌條件是120℃，20－30min。2、原理：在高溫及有水分存在的條件下，微生物細胞中的蛋白質極易凝固而引起微生物的死亡。3、特點：經濟，快速，適用于大量培養基及發酵設備的滅菌。第三十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日（四）介質過濾除菌對培養液中某此不耐熱的成分可采用過濾除菌法。發酵過程中所用的大量無菌空氣也是用過濾除菌法。第三十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、化學滅菌

1、定義：化學藥劑滅菌是通過藥劑與微生物細胞接觸而發生諸如蛋白質變性等作用而達到殺滅微生物的目的。2、滅菌用化學藥劑必須具備以下四個條件：（1）殺菌譜廣。有效濃度低且殺滅微生物的速度快。（2）性質穩定，易溶于水且可在常溫下使用。（3）基本上不受有機物、酸、堿和其他物理化學因素的影響。（4）無腐蝕性，無毒或低毒，使用安全。第三十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日3、常用的化學藥劑：乙醇、甲醛、苯扎溴銨（新潔爾滅）、戊二醛、環氧乙烷、漂白粉和苯酚（石炭酸）等。4、用途：化學滅菌主要用來進行皮膚表面、器具及無菌區域的滅菌，很少用于培養基的滅菌。第三十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日第二節培養基及有關設備的滅菌

一、實罐滅菌

分批滅菌是將配制好的培養基投入發酵罐中，經過間接蒸汽預熱后，直接通入飽和蒸汽使培養基和設備一起滅菌。流程：培養基預熱培養基滅菌冷卻第三十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日第三十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日注意事項：1．培養基預熱：80～90℃。避免產生冷凝水造成培養基稀釋。2．培養基滅菌：120～130℃，保溫30min。各路蒸汽進口要暢通，防止逆流，罐內液體翻動要劇烈，以使罐內物料達到均一的滅菌溫度。排汽量不宜過大，以節約蒸汽用量。3．冷卻：滅菌將要結束時，應立即引入無菌空氣以保持罐壓，然后開夾套或蛇管冷卻水冷卻，避免罐壓迅速下降，產生負壓而抽吸外界空氣。第三十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日（一）實罐滅菌

優點：不需要專門的滅菌設備，投資少，操作簡單，滅菌效果可靠。

缺點：設備利用率較低；滅菌過程需要時間較長，培養基營養成分破壞較多。

該法多用于中小型發酵罐和種子罐的滅菌。第四十頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、空罐滅菌空罐滅菌是指將飽和蒸汽通入未加培養基的發酵罐或種子罐內，進行罐體濕熱滅菌的過程。空罐滅菌一般維持罐壓1.5×105～2.0×105Pa，罐溫125～130℃，30～45min，直接蒸汽法。滅菌后為避免罐壓急速下降造成負壓，要等到經過滅菌的無菌培養基輸入罐內后，才可以開冷卻水冷卻。第四十一頁，共五十六頁，2022年，8月28日（二）空罐滅菌

優點：罐內死角少，蒸汽傳熱效率高，滅菌效果好。

適用范圍：沒有使用的發酵罐、染菌罐、發酵罐更換菌種、培養基連續滅菌工藝、發酵罐及附屬設備。第四十二頁，共五十六頁，2022年，8月28日三、連續滅菌培養基在發酵罐外，通過專用滅菌裝置，連續不斷加熱，維持保溫和冷卻后，送入已滅菌的發酵罐內的工藝過程，又稱連消。流程：培養基預熱連續滅菌維持滅菌溫度冷卻發酵罐第四十三頁，共五十六頁，2022年，8月28日注意事項：1．培養基預熱：60一75℃，避免連續滅菌時由于料液與蒸汽溫度相差過大而產生水汽撞擊聲。2．連續滅菌：連續滅菌的溫度一般以126一132℃為宜。3．維持滅菌溫度：利用維持罐使料液在滅菌溫度下保持5—7min，以達到滅菌的目的。4．冷卻：采用冷水噴淋時，噴淋前冷卻管內應充滿填料。第四十四頁，共五十六頁，2022年，8月28日特點：（1）連續滅菌的時間短、溫度較高。培養基受到的破壞較少，故質量較好。連續滅菌時蒸汽負荷均衡一致。（2）不足之處是所需設備較多，操作較麻煩，染菌的機會也相應增多。第四十五頁，共五十六頁，2022年，8月28日四、發酵附屬設備及管路的滅菌

發酵附屬設備有總空氣過濾器、管道、計量罐、補料罐等。空罐滅菌使罐內蒸汽壓力達到1.5×105Pa，保溫45min。補料罐的實罐滅菌條件應視物料性質而定。第四十六頁，共五十六頁，2022年，8月28日第三節空氣過濾除菌抗生素產生菌一般都是好氧菌,所以發酵過程中必須通入無菌空氣來滿足產生菌生理上的需要。如果空氣除菌不當或除菌設備失效,就會引起大面積染菌,造成極大的損失。因此,空氣除菌是抗生素發酵生產極其重要的一環。第四十七頁，共五十六頁，2022年，8月28日第三節空氣過濾除菌

一、介質除菌的機制

1．沉降作用2．截留作用

3．慣性碰撞4．擴散現象5．靜電吸附第四十八頁，共五十六頁，2022年，8月28日二、空氣過濾介質1、要求：能耐高溫、高壓，不易被油水污染。且成本低、易更換。2、常用的空氣過濾介質：棉花、活性炭、玻璃棉、超細玻璃纖維紙、石棉濾板等。3、新型過濾介質：膜過濾器。第四十九頁，共五十六頁，2022年，8月28日折疊式膜過濾器：設備體積小，過濾效率高，操作、維修、更換方便，效果較好。其濾膜采用進口聚四氟乙烯膜,濾