1.2基因工程的基本操作程序補充：基因的結構（1）原核生物基因結構編碼區非編碼區非編碼區編碼區上游編碼區下游編碼蛋白質調控遺傳信息的表達（調控程序）啟動子終止子…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………...G…T‥…......TACACGTGCATCAAT………...C編碼區非編碼區非編碼區啟動子終止子ATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATRNA聚合酶AUGUGCACGUAGUUA

啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。

RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結合位點并與其結合的一種蛋白質.

終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉錄終止。①不能轉錄為信使RNA，不能編碼蛋白質的序列。：能轉錄相應的信使RNA，能編碼蛋白質的序列。編碼區非編碼區原核細胞的基因結構②是調控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區上游的RNA聚合酶結合位點。（也就是啟動子）（2）真核細胞的基因結構編碼區非編碼區非編碼區與RNA聚酶結合位點內含子外顯子能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子

不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子，內含子能轉錄為信使RNA啟動子終止子編碼區上游編碼區下游內含子：

外顯子：

真核細胞的一個基因的編碼區轉錄出前體mRNA，需把其中的內含子切除，外顯子拼接成成熟mRNA。真核細胞的基因結構編碼區非編碼區外顯子：能編碼蛋白質的序列內含子：不能編碼蛋白質的序列：有調控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區上游的RNA

聚合酶結合位點。非編碼序列：包括非編碼區和內含子原核細胞真核細胞不同點編碼區是_____的編碼區是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質的______和具有調控作用的______區組成的原核細胞與真核細胞的基因結構比較思考編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？連續不連續編碼區非編碼真核基因長1.2基因工程的基本操作程序二.基因表達載體的構建三、將目的基因導入受體細胞四、目的基因的檢測與鑒定一.目的基因的獲取基本操作的四個步驟一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質的結構基因2、獲取目的基因的方法（1）從基因文庫中獲取（2）利用PCR技術擴增（3）人工合成生物抗逆性相關基因、與優良品質相關的基因、與生物藥物和保健品相關的基因、與毒物降解相關的基因、與工業用酶相關的基因等

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（如:cDNA文庫）1、基因文庫（一）從基因文庫中直接獲取一、目的基因的獲取限制酶酶基因組組DNA基因重重組轉化細細菌體外包包裝1)基因組組文庫庫(Genomiclibrary)是指將將某種種生物物體的的全部基基因組組DNA，用限制性性內切切酶或機械械力量量切割成一定定長度度范圍圍的DNA片段段，再再與合合適的的載體在體外外重組組后，，導入入受體菌菌的群群體中中儲存存，這個個群體體就稱稱為該該生物物基因組組文庫庫。其目的的是分分離有有用的的目的的基因因和保保存某某種生生物的的全部部基因因。cDNA(互補DNA)：是用某某種生生物發發育的的某個個時期期的mRNA反轉錄錄產生的的多種種互補DNA（也叫叫cDNA）片段，與載體連連接后儲存存在一一個受受體菌菌群中中，這這個受受體菌菌群就就叫做做這種種生物物的cDNA文庫2)cDNA文庫(cDNAlibrary)基因重重組反轉錄錄酶mRNAcDNA提取某種種生物的的全部DNA一定大小小的DNA片段導入受體體菌中儲儲存用適當的限制酶切割將DNA片段與載體連接基因組文文庫直接分離離法(鳥槍法)多用于原原核生物物2、基因組文文庫的建建立方法法某種生物物的單鏈鏈mRNA單鏈互補補DNA雙鏈cDNA片段導入受體體菌中儲儲存cDNA文庫反（逆））轉錄酶酶DNA聚合酶3、cDNA文庫的的構建-----反轉轉錄法多用于真核生物物文庫類型

cDNA文庫基因組文庫

文庫大小基因中啟動子（具有啟動作用的DNA片段）基因中內含子(位于編碼蛋白質序列的非編碼DNA片段）基因多少物種間的基因交流小大無有無有某種生物物的部分分基因某種生物物的全部部基因可以部分基因因可以基因組文文庫和部部分基因因組文庫庫(cDNA文庫)比較基因組文文庫與部部分基因因文庫的的關系怎樣從基基因文庫庫中得到到我們所所需的目目的基因因呢?依據：目目的基因因的有關關信息。。如：根據據基因的的核苷酸酸序列基因的功功能基因在染染色體上上的位置置基因的轉轉錄產物物mRNA基因翻譯譯產物蛋蛋白質等等特性4、從基因文文庫中得得到目的的基因的的方法尋根問底底——為什么要要構建基基因文庫庫？直接接從含有有目的基基因的生生物體內內提取不不行嗎？？提示：構構建基因因文庫是是獲取目目的基因因的方法法之一，，并不是是惟一的方方式。如果所所需要的的目的基基因序列已知知，就可以以通過PCR方式從含有該該基因的的生物的的DNA中，直接接獲得，，也可以以通過反轉錄，用PCR方式從mRNA中獲得，，不一定定要構建建基因文文庫。但但如果所所需要的的目的基基因的序列完全全不知，或只知知道目的的基因序列的一一段，或想從從一種生生物體內內獲得許多多基因，或者想想知道這這種生物物與另一一種生物物之間有多少基基因不同同，或者想想知道一一種生物物在個體體發育的的不同階段段表達的的基因有有什么不不同，或者想想得到一一種生物物的全基基因組序序列，往往往就需需要構建建基因文文庫。18（二）利利用PCR擴增目的的基因(二)利用PCR技技術擴增增(二)利用PCR技技術擴增增①概念念：PCR全稱為_______________，是一項項在生物____復制___________的核酸合合成技術術③條件：：_______________________、_______________、、___________(做啟啟動子)、___________。②原理：：__________④方式：：以_____方式擴增增，即____（n為擴增循循環的次數數）⑤結果：：聚合酶鏈鏈式反應應體外特定DNA片段DNA復制已知基因因的核苷苷酸序列列四種脫氧氧核苷酸酸一對引物物熱穩定DNA聚合酶（（Taq酶）指數2n使目的基基因的片片段在短短時間內內成百萬萬倍地擴擴增前提條件件⑥過程：：a、DNA變性（90℃-96℃℃）：：雙雙鏈鏈DNA模板板在熱熱作作用用下下，，_____斷裂裂，，形形成成___________b、、退退火火（復復性性55℃℃-65℃℃））：：系系統統溫溫度度降降低低，，引物物與DNA模板結結合，形形成局部部________。。c、延伸伸（70℃℃-75℃）：：在DNA聚聚合酶的作用用下，從從引物的的5′端→→3′端端延伸，合合成與模模板互補補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈DNA合成方向向總是從從子鏈的的5′端→→3′端端延伸PCR技術擴增增與DNA復制的比比較PCR技術DNA復制相同點原理原料條件不同點解旋方式場所酶結果堿基互補補配對四種脫氧氧核苷酸酸模板、能能量、酶酶DNA在高溫下下變性解解旋解旋酶催催化體外復制制細胞核內內熱穩定DNA聚合酶細胞內的的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個個DNA分子（三）、人工合合成法：：基因較小，核苷酸酸序列已知知，可以利利用DNA合成儀人工合成成反轉錄法目的基因因的信使使RNA目的基因因化學合成成法肽鏈氨基基酸序列列信使RNA序列基因的核核苷酸序序列目的基因因合成逆轉錄人工合成成法推測推測單鏈DNA合成1、下列屬屬于獲取取目的基基因的方方法的是是()①利用mRNA反轉錄錄形成②②從基因因組文庫庫中提取取③從受體細細胞中提提取④④利用PCR技技術⑤利用DNA轉錄錄⑥⑥人人工合成成A.①②②③⑤B.①②⑤⑤⑥C.①②②③④D.①①②④⑥⑥2、有關基基因工程程的敘述述正確的的是（（））A、限制制酶只在在獲得目目的基因因時才用用B、重組組質粒的的形成在在細胞內內完成C、質粒粒都可作作為運載載體D、蛋白白質的結結構可為為合成目目的基因因提供資資料D1.作用：二.基因表達達載體的的構建———核心心IMN2.組成：①使目的基基因在受受體細胞胞中穩定定存在并并遺傳給給子代。②同時使使目的基基因能表表達和發發揮作用用。(3)終止子子：(4)標記基基因：：(2)啟動子子：(1)目的基基因。。（5）復制制原點點：不同受受體細細胞，，目的的基因因導入入受體體細胞胞的方方法不不同，，基因因表達達載體體的構構建有有所差差異。。是RNA聚合酶酶識別別和結結合部部位。。是使轉轉錄在在需要要的地地方停停止。。是鑒別別受體體細胞胞中是是否含含有目目的基基因從而將將含有有目的的基因因的細細胞篩篩選出出來。。是復制制的起起點。。①載體與表達載載體的區別別：二二者都都有標標記基基因和和復制制原點點兩部部分DNA片段。。表達載載體在在載體體基礎礎上增增加了了目的的基因因、啟啟動子子、終終止子子三部部分結結構②用到的的工具具酶：：既用到到限制制酶切切割載載體，，又用用到DNA連接酶酶將目目的基基因和和載體體拼接接，兩兩種酶酶作用用的化化學鍵鍵都是是磷酸酸二酯酯鍵③啟動子子、終終止子子對于目目的基基因表表達必必不可可少④目的基基因不不能單單獨進進入受受體細細胞，，必需以以表達達載體體的方方式攜攜帶進進去。。注意尋根問問底：：將目目的基基因直直接導導入受受體細細胞不不是更更簡便便嗎？？如果果這么么做，，結果果會怎怎樣？？提示：有人人采用總DNA注射法進行行遺傳轉化化，即將一一個生物中中的總DNA提取出來，，通過注射射或花粉管管通道法導導入受體植植物，沒有有進行表達達載體的構構建，這種種方法針對對性差，完完全靠運氣氣，也無法法確定什么么基因導入入了受體植植物。此法法目前爭議議頗多，嚴格來講講不算基基因工程程。思考與探探究：1.作為基因因工程表表達載體體，只需需含有目目的基因因就可以以完成任任務嗎？？為什么么？不可以。。因為目目的基因因在表達達載體中中得到表表達并發發揮作用用，還需需要有其其他控制制元件，，如啟動動子、終終止子和和標記基基因等。。必須構構建上述述元件的的主要理理由是：：（1）生物物之間進進行基因因交流，，只有使使用受體體生物自自身基因因的啟動動子才能能比較有有利于基基因的表表達；（2）通過過cDNA文庫庫獲得的的目的基基因沒有有啟動子子，只將將編碼序序列導入入受體生生物中無無法轉錄錄；（3）目的的基因是是否導入入受體生生物中需需要有篩篩選標記記；（4）為了了增強目目的基因因的表達達水平，，往往還還要增加加一些其其他調控控元件，，如增強強子等；；（5）有時時需要確確定目的的基因表表達的產產物存在在于細胞胞的什么么部位，，往往要要加上可可以標識識存在部部位的基基因（或或做成目目的基因因與標識識基因的的融合基基因），，如綠色色熒光蛋蛋白基因因等。3、將目的的基因導導入受體體細胞轉化——方法將目的基基因導入入植物細胞胞將目的基基因導入入動物細胞胞將目的基基因導入入微生物細細胞農桿菌轉轉化法基因槍法法花粉管通通道法——顯微注射射法——感受態細細胞法目的基因因進入_________內，并且且在受體體細胞內內維持_____和_____的過程受體細胞胞穩定表達常用的受受體細胞胞：有大腸桿桿菌、枯枯草桿菌菌、土壤壤農桿菌菌、酵母母菌和動動植物細細胞等。。1、將目的的基因導導入植物物細胞的的方法：：（1）農桿菌菌轉化法法①農桿菌菌特點：：易感染雙雙子葉植植物和裸裸子植物物，對大大多數單單子葉植植物沒有有感染能能力②原理：：Ti質粒上的T-DNA可以轉移移到受體體細胞，，并整合到受受體細胞胞染色體體的DNA上。雙子葉植植物、祼子植物物適用生物物?目的基因因Ti質粒上的的T－DNA插入植物細胞胞農桿菌染色體DNA上維持穩定定和表達達并整合到到導入感染同時T-DNA導入③過程：：④優點：比較經濟濟和有效效思考與探探究：2.根據農桿桿菌可將將目的基基因導入入雙子葉葉植物的的機理,你能分析析出不能能導入單單子葉植植物的原原因嗎?若將一個抗病病基因導入小小麥中,理論上講你應應該怎樣做?①要選擇合適的的農桿菌菌株株，因為不是是所有的農桿桿菌菌株都可可以侵染單子子葉植物；②要加趨化和誘誘導的物質，，一般為乙酰酰丁香酮等，，目的是使農農桿菌向植物物組織的受傷傷部位靠攏（（趨化性）和和激活農桿菌菌的Vir區區（誘導）的的基因，使T-DNA轉轉移并插入到到染色體DNA上。37（2）基因槍法：利用壓縮氣體體產生的動力力，將包裹裹在金屬粒表表面的表達載載體DNA打入受體細胞胞中，使目的的基因與其整整合并表達的的方法①操作方法：：②金屬粒：將目的基因導導入單子葉植植物細胞鎢粉粒子和金金粉粒子，粒子的直徑一一般在0.6～4um。④適用：單子葉葉植物③缺點：成本較高（3）花粉管通道法法：將目的基因導導入植物細胞胞①操作方法：：②特點：在植物受粉后后，花粉形成成花粉管還末愈合前前期，剪去柱柱頭，然后，滴入DNA（含目的基因因）使目的基基因借助花粉管通通道進入受體體細胞十分簡便經濟濟③例：轉基因抗蟲棉棉2.將目的基因導導入動物細胞胞顯微注射技術術提純含目的基基因的表達載體體取出受精卵顯微注射受精卵移植入輸卵管或子宮發育成具新性狀的動物①方法：②程序：培養成早期胚胎①原核生物特特點：繁殖快、多為為單細胞、遺遺傳物質相對對較少，故早早期常作為受受體細胞。大腸桿菌細胞胞感受態細胞用Ca2+處理重組表達載體體DNA溶于緩沖液混合轉入②方法：常用菌：大腸桿菌3.將目的基因導導入微生物細細胞通過標記基因因，進行篩選選和檢測導入過程完成成后，全部受受體細胞都能能攝入重組DNA分子嗎？真正能攝入重重組DNA分子的受體細細胞很少。所以要對受體體細胞作怎樣樣的處理？對受體細胞中中是否導入了了目的基因進進行檢測怎樣進行檢測測？4、目的基因的的檢測與鑒定定——檢查是否成功功檢測鑒定——①檢測轉基因因生物染色體的DNA上是否否插入②檢測測目的③檢測測目的的基因因是否翻翻譯成成蛋白白質抗蟲鑒鑒定、、抗病病鑒定定、活活性鑒鑒定等等方法——方法——方法——DNA分子雜雜交分子雜雜交抗原抗抗體雜雜交DNA分子雜雜交示示意圖圖采用一一定的的技術術手段段，將將兩種種生物物的DNA分子的的單鏈鏈放在在一起起，如如果這這兩個個單鏈鏈具有有互補補的堿堿基序序列，，那么么，互互補的的堿基基序列列就會會結合合在一一起，，形成成雜合合雙鏈鏈區；；在沒沒有互互補堿堿基序序列的的部位位，仍仍然是是兩條條游離離的單單鏈。。堿基互互補配配對原理：：1.檢測轉基因因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢檢測轉轉基因因生物物染色色體的的DNA上上是否否插入入了目目的基基因基因探探針：：放射性性同位位素等等標記記含有有目的的基因因的DNA片段段方法——DNA分子雜雜交技技術方法——分子雜雜交技技術（2）檢測測目的的基因因是否轉轉錄出出了mRNA探針15N15N轉基因因生物物的mRNA14N提取（3）檢測測目的的基因因是否否翻譯譯成蛋蛋白質質方法———蘇云金桿菌Bt毒素蛋蛋白將Bt毒蛋白白注射射小鼠鼠體內內從小鼠鼠血管管抽出出血液液分離離出抗抗Bt毒素的的抗體體抗體Bt毒素蛋蛋白（（抗原原）出現雜雜交帶帶脫分化化組織培培養證明：：提取蛋蛋白質質與Bt毒素蛋蛋白質質一樣樣抗原-抗體雜雜交例：用用棉鈴鈴飼喂喂棉鈴鈴蟲，，如蟲蟲吃后后不出出現中中毒癥癥狀，，說明明未攝攝入目目的基基因或或攝入入目的的基因因未表表達。。如蟲蟲吃后后中毒毒死亡亡，則則說明明攝入入了抗抗蟲基基因并并得到到表達達。2.鑒定———個體生物物學水平平的鑒定定（1）多細胞胞個體抗蟲、抗抗病結種種實驗，，活性比比較實驗驗不能，受受體細胞胞必須表表現出特特定的性性狀，才才能說明明目的基基因完成成了表達。受體細胞胞攝入DNA分分子后就就說明目目的基因因完成了表表達嗎？？若不能表表達，要要對抗蟲蟲基因再再進行修飾。無表達產物無表達產物有表達產物無表達產物細菌的檢檢測，將將每個受體細胞胞單獨培培養形成菌落落，檢測菌菌落中是是否有目目的基因因的表達達產物。。淘汰無無表達產產物的菌菌落，保保留有表表達產物物的進一一步培養養、研究究。（2）單細胞胞生物3.利用大腸腸桿菌可可以生產產出人的的胰島素素，聯系系前面有有關細胞胞器功能能的知識識，結合合基因工工程操作作程序的的基本思思路，思思考一下下，若要要生產人人的糖蛋蛋白，可可以用大大腸桿菌菌嗎？有些蛋白白質肽鏈鏈上有共共價結合合的糖鏈鏈，這些些糖鏈是是在內質質網和高高爾基復復合體上上加工完完成的，，內質網網和高爾爾基復合合體存在在于真核核細胞中中，大腸腸桿菌不不存在這這兩種細細胞器，，因此，，在大腸腸桿菌中中生產這這種糖蛋蛋白是不不可能的的。思考與探探究：53（1）從小鼠鼠中克隆隆出β-珠蛋白白基因的的編碼序序列（cDNA）（2）將將cDNA前接接上在大大腸桿菌菌中可以以適用的的啟動子子和終止子，另外加加上抗四四環素的的基因，，構建成成一個表表達載體體。（3）將表達達載體導導入無四四環素抗抗性的大大腸桿菌菌中，然然后在含含有四環環素的培培養基上上培養大大腸桿菌菌。如果果表達載載體未進進