基因工程第七章動物基因工程（上）湖南科技大學生命科學學院第七章動物基因工程（上）一、動物轉基因技術的基本概念二、動物轉基因的載體1.病毒載體2.反轉錄載體三、外源基因導入動物體內的研究方法轉基因動物轉基因動物（transgenicanimal)：指動物基因組中整合有利用轉基因技術所導入的外源基因（或特定的DNA片段）。整個技術則稱為動物轉基因技術(transgenictechnology或transgenesis)。理論上講任何動物都可以通過性系基因操作成相應的轉基因動物（如：魚、鼠、羊、牛等）。轉基因動物1、1982年，R.D.Palmiter等采用顯微注射法，將大鼠生長基因導入小鼠受精卵的雄原核內，得到轉基因小鼠以來，成功構建了各種轉基因動物。2、轉基因動物技術具有廣泛的應用：研究基因的表達與功能，生產生物大分子；生產人體蛋白；改良動物；醫用轉動物模型。3、轉基因人的研究只能限于體細胞的基因治療，具有遺傳特征修飾的轉基因人的研究，可否邁出歷史的一步？問題多多。4、動物基因轉移無論用何技術，轉移效率極低。第一個轉基因鼠攜帶了生長激素基因的轉基因鼠轉基因動物一、動物轉基因技術的基本概念1.外源目的基因的分離；2.外源基因與載體相連；3.將外源目的基因重組DNA導入生殖細胞或胚胎干細胞；4.接種后的受精卵移植到雌性受體的子宮，使其順利完成胚胎發育（胚胎轉移技術，ET）；5.移植后的受精卵發育生長為后代，胚胎發育生長鑒定及篩選；6.利用這些能產生外源蛋白的動物作為種畜或種禽，培育新的純合系。（一）動物轉基因技術的程序動物基因轉移的起點和終點分別為受精卵和含有整合轉基因的動物子代。在這個過程中，轉基因的效率極低。以小鼠轉基因為例：以小鼠轉基因為例：注射外源基因后受精卵的存活率為86％；將受精卵移殖到母鼠子宮內后受精卵的存活率為25％；母鼠的懷孕率為80％；轉基因在基因組上的整合率為24％；因此小鼠轉基因的總有效率約為4％。（二）動物轉基因的效率1.基因組片段：分子較大，保持較完整的基因結構。2.融合基因：將不同來源的結構基因、非編碼序列、表達調控序列重組成雜合單元。3.小基因：分別取同一基因的某一區域或若干區域組成轉基因。4.插入基因：含有在動物染色體上隨機或特異性插入位點，可裝標記基因。5.置換基因：兩側含動物基因或其他DNA區域的同源序列。（三）動物基因的結構1.轉基因的時空特異性表達動物基因表達調控的顯著特性：時空特異性，特別是在發育過程中，相關基因的時序特異性和組織特異性表達更為嚴格。2.轉基因的可控表達誘導動物細胞內的轉基因，對其穩定高效表達至關重要，轉基因的誘導條件取決于受體細胞的性質和啟動子的類型。3.轉基因的共抑制效應在轉基因動物體內，轉基因的表達常會發生轉基因的失活，也稱為轉基因沉默。（四）動物基因的表達特性1.共抑制只發生在轉基因與同源的內源性基因之間，對其他的基因表達不產生影響；2.如果轉基因與內源基因發生體內重組，則共抑制效應隨之消失，基因表達恢復正常；3.共抑制現象的發生與結構基因的編碼區有關，但不依賴于啟動子的來源和性質。4.兩個相同的轉基因之間也能發生共抑制效應。（五）共抑制效應共抑制效應的特征1.轉基因與其同源的內源性基因相互作用，形成某種狀態而影響兩者表達；2.轉基因與內源基因競爭性結合核基質和核包膜上轉錄翻譯必須的非擴散元件，導致相互抑制；3.兩者轉錄出互為反義的RNA結構，使之失活并迅速降解；4.由于轉基因的存在，受體細胞中mRNA的大量積累，并激活某些未知酶系的表達，導致mRNA降解。（五）共抑制效應造成共抑制效應的原因

轉基因動物體內的轉基因表達單方面失活，而同源的內源性基因卻表達正常。

1.轉基因被受體細胞識別為異己DNA，并將它甲基化修飾，使其失活；

2.轉基因整合在不合適的染色體部位，受局部條件影響而不表達；

3.轉基因本身的結構不利于其表達。（六）轉基因表達單方面失活的原因人類與老鼠共享著80％的遺傳物質和99％的基因，人類和老鼠基因組同源度高，對它進行比較研究可以得知很多關于人類疾病和生理機能的研究，因此了解老鼠有助于了解人類本身。（七）為什么選擇鼠作為轉基因動物模型1.奶汁可以由乳腺不斷地分泌，而且產量很高，長期收集也不會對動物造成傷害；2.將新的藥物蛋白限制在乳腺內生產，最后分泌到乳汁中，一般不易對轉基因動物的正常生理活動造成影響；3.乳腺分泌的蛋白質是經過正常的高等哺乳動物的翻譯后加工的，這使得生產的藥物蛋白更接近于人類自身的蛋白質；4.乳汁中蛋白純化起來相對較為容易，而且在乳汁中含有的其他蛋白質也為數不多。（七）為什么選擇乳腺來生產藥物蛋白（七）為什么選擇乳腺來生產藥物蛋白1.應用于動物基因組結構與功能的研究(1)以報告基因為轉基因探測動物或人基因組中時空特異性表達調控序列；(2)以反義基因為轉基因滅活相關的內源基因，構建基因表達缺陷——功能喪失的動物模型；(3)以同源基因為轉基因體內檢測其表達特性及產物的生物效應。2.轉基因技術改良動物物種。3.對人體中若干分子疾病的基因治療。4.利用此技術構建優異的動物生化反應器。由于鼠的生殖周期短，產仔數多，基因整合率較高。飼養成本較低，因此成為轉基因動物實驗的首選動物。（八）動物轉基因的意義二、動物轉基因病毒載體1.有能夠被真核細胞識別的有效的啟動子；2.能夠持續地復制使基因達到相當高濃度，并實現有效的表達；3.能有效控制自己的作用因子，長時間的保持高拷貝的外源基因；4.能高效穩定地整合到染色體；5.病毒外殼蛋白能夠識別細胞接受器，能夠將外源蛋白高效地導入宿主細胞。（一）病毒載體的特點1.小型20面體蛋白質顆粒，3種病毒外殼包裝一條環型的病毒基因組DNA；2.它的DNA剪輯模型相當復雜；3.SV40基因組中存在一個增強子序列，它的功能是促進病毒有效的早期轉錄，能夠促進激發或增強位于鄰近的任何啟動子的轉錄活性。（二）SV40病毒1.輔助病毒互補的重組的反轉錄病毒質粒載體；2.無需輔助病毒互補的重組的反轉錄病毒質粒載體；3.廣寄主范圍的反轉錄病毒載體；（三）反轉錄病毒載體類型三、動物轉基因的基本研究方法最早發展并較為完善的系統是小鼠進行轉基因實驗；從20世紀80年代初期到現在，人們已經將上百種不同的基因轉人了小鼠，這些研究為進一步了解高等動物的基因表達調控、腫瘤的發生、免疫特異性、胚胎發生、發育過程以及分子遺傳學等基礎生物學過程做出了重要貢獻；同時，在判斷利用家畜生產人類藥物的可行性、構建人類各種遺傳疾病的生物醫學模型方面，轉基因鼠也發揮了重要的作用。動物轉基因技術的基本研究方法一、利用反轉錄病毒載體將外源基因轉入胚胎早期細胞，然后移植到受體動物中；二、利用顯微注射法將DNA直接注射入受精卵的精前核中；三、將基因工程改造過的胚胎干細胞導入早期胚胎中。用該方法已成功地得到了豬、羊、雞、免、牛、魚等多種轉基因動物。動物轉基因技術的基本方法

在各種動物轉基因技術中，通過逆轉錄病毒載體把外源基因整合到受體細胞核基因組中是目前最有效的方法之一。一、逆轉錄病毒法一、逆轉錄病毒法通過逆轉錄病毒載體法獲得轉基因小鼠1.反轉錄病毒載體容量有限，只能轉移小片段DNA(＜10kb)。轉入的基因易缺少其鄰近的調控序列。2.

反轉錄病毒載體因缺失了復制功能序列，在復制載體DNA所用的輔助病毒(helpervirus)基因組也可能與目的基因一起整合到同一細胞核中。另外轉基因動物自身也有可能產生輔助病毒株。3.目前的技術水平要完全杜絕反轉錄病毒在轉基因動物商品中的污染是很難做到的。一、逆轉錄病毒法逆轉錄病毒法的缺陷用顯微注射器把DNA直接注射到動物的細胞質或細胞核中（直接注射和穿刺導入法）。受體細胞：

1）多為沿培養皿壁生長的單層細胞；

2）動物的卵細胞。轉化效率：取決于注射DNA性質和注射技巧。二、顯微注射法向供體雌鼠注射懷孕母馬的血清，48h后再注射人的絨毛膜促性腺激素，處理的雌鼠可以產約35個卵細胞/次（正常雌鼠只能產5—10個卵細胞/次）。從交配后雌鼠體內取出受精卵。外源基因注射進受精卵。微注射的轉入基因常要刪除原核載體序列的線性DNA。在哺乳動物中，精子進入卵細胞后的lh內，精前核和卵細胞的核都是分開的。等到卵細胞核完成減數分裂，成為卵前核時，核融合才進行，這稱為核配。DNA微注射要在精前核時注射才能有效。精前核比卵前核更大，因此可在顯微鏡下找到處在精前核狀態下的受精卵。二、顯微注射法（1）二、顯微注射法（1）

注射完成后，用顯微外科手術將25—40個受精卵移植到假孕雌鼠的子宮內，制造雌鼠假孕（可以讓它與切除了輸精管的不育雄鼠交配），將受精卵移入代孕母鼠子宮中大約3周后，接受過注射的受精卵發育生長為幼鼠，由代孕母鼠產下。二、顯微注射法（2）假孕母鼠二、顯微注射法（2）轉基因動物進行檢測：（1）取一小截幼鼠的尾巴，提取DNA進行Southern雜交或PCR檢測，看是否存在轉入基因。（2）將它與另一只鼠進行交配來確定轉入基因是否存在其生殖系中。（3）通過對子代進行雜交產生純合的轉基因鼠。二、顯微注射法（3）通常發育成轉基因動物的受精卵一般占注射受精卵的5％。大多數情況下通過微注射法獲得轉基因動物的成功率只有l/1000。對于顯微注射用的DNA的要求高：1）轉入的外源基因要能夠高效表達；2）可以誘導表達；3）具有幫助提高整合效率的序列。在注射的載體中加上MAR序列(matrixattachregion)，這種序列位于染色體的基部，具有隔離作用，可以幫助基因高效表達；4）在外源基因兩端可加入微衛星序列，因在染色體上也有微衛星序列，兩個微衛星序列可以幫助發生同源重組，提高整合效率。二、顯微注射法（4）用顯微注射法獲得的幾種轉基因動物的成活率轉入基因的結構示意圖由于微注射法所注射的DNA在宿主基因組中是隨機整合的，因此轉入基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，從而干擾該基因的正常表達，影響轉基因動物的正常發育和代謝；有的外源基因的表達具有時間性，得到的轉基因動物可能只在一段時期內表達外源基因；有些個體可能因基因插入位點不合適而無法表達產物；還有些個體基因拷貝數過多導致表達過量，干擾自身的正常生理活動。由于這些原因，DNA顯微注射法的總效率還是比較低，但是這種方法仍然是目前獲得轉基因鼠的常規方法。二、顯微注射法（4）多能胚胎干細胞：動物胚泡發育期的胚細胞重新導入另一胚泡期的胚之后，它仍然保持著分化成其他類型細胞的能力，這種細胞叫做多能胚胎干細胞。胚胎干細胞(embryonicstemcell，簡稱ES細胞)的獲得：分離胚泡的內層細胞團(innercellmass)進行培養。ES細胞在無飼養層的平板中培養時會持續分化為肌細胞、神經細胞等多種功能細胞，只有在含有成纖維細胞的飼養層或白血病抑制因子(1eukemiainhibitoryfactor，LIF)的飼養層上生長時，才能保持其未分化狀態，保持ES細胞的潛在分化能力。三、胚胎干細胞法從鼠的胚胎細胞培養胚胎干細胞1.在ES細胞的培養過程中，可通過基因工程操作，利用反轉錄病毒載體、電擊法等多種方法將外源基因導人ES細胞，而不改變它的分化能力。2.將有功能的轉入基因整合到ES細胞基因組內的某一非必需基因位點上，然后對這些細胞進行篩選培養，用于產生轉基因動物。3.這種方法避免了在DNA微注射法與反轉錄病毒載體方法中存在的基因隨機整合的問題。三、胚胎干細胞法通過胚胎干細胞獲得轉基因小鼠示意圖PCR法檢測是否特異整合同源重組示意圖1.正確整合的轉基因胚胎干細胞系經培養后就可以移入胚泡期的胚胎了。將這些胚胎移植到假孕的代孕母鼠子宮內，這樣產生的子代其部分生殖系細胞就是由轉基因的ES細胞形成的。然后在得到的轉基因鼠間進行雜交，子代再配對雜交。2.