血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定（賴氏法）

【實(shí)驗(yàn)要求】

掌握血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定（賴氏法）的原理操作方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制；了解試劑的配制和臨床意義。

【實(shí)驗(yàn)原理】

L-丙氨酸與α-酮戊二酸在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanineaminotransferase，ALT，EC2.6.1.2）催化下生成丙酮酸和L-谷氨酸，加入2，4-二硝基苯肼終止酶反應(yīng)，并與丙酮酸生成丙酮酸-2，4-二硝基苯腙，苯腙在堿性條件下顯紅棕色，在波長(zhǎng)510nm處讀取吸光度，即可計(jì)算出丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性。

【操作】

1、試劑配制1份4N氫氧化鈉和9份蒸餾水混合均勻，即可使用將酶標(biāo)準(zhǔn)液（3.0mmol/L）取出1ml加0.5ml蒸餾水使酶標(biāo)準(zhǔn)備液濃度變?yōu)?.0mmol/L2.ALT標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）按表1向各管加入相應(yīng)試劑。表一：管號(hào)01234基質(zhì)液（ul）2502252001751502.0mmol/L標(biāo)準(zhǔn)液（ul）-255075100蒸餾水（ul）5050505050活力單位（U）02857971502.混合37℃水浴30分鐘，然后各管加顯色劑250μL，37℃水浴20分鐘取出，各管加稀釋氫氧化鈉2.5ml,室溫放置3分鐘上機(jī)波長(zhǎng)510nm測(cè)定.3.以吸光度值為縱坐標(biāo)，卡門氏單位為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度值對(duì)活性單位作圖，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.標(biāo)本的測(cè)定按表2操作。表二：對(duì)照管樣品管基質(zhì)液（ul）250樣品（ul）5050混合37℃水浴30分鐘顯色劑250μL250μL基質(zhì)液（ul）25037℃水浴20分鐘稀釋氫氧化鈉2.5ml2.5ml室溫放置3min，在波長(zhǎng)510nm處，以蒸餾水調(diào)零，讀取各管吸光度。【計(jì)算】以空白調(diào)零，測(cè)定管吸光度減去對(duì)照管吸光度的差值為標(biāo)本的吸光度，用該值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得ALT的卡門單位。或者以對(duì)照管調(diào)零，直接讀出測(cè)定管吸光度值，用該值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得ALT的卡門單位。【參考范圍】0～50卡門單位【臨床意義】1.血清ALT活性增高可見于下述疾病：（1）肝膽疾病傳染性肝炎、肝癌、肝硬化活動(dòng)期、中毒性肝炎、脂肪肝、膽管炎和膽囊炎等；（2）心血管疾病心肌梗死、心肌炎、心力衰竭時(shí)的肝臟淤血、腦出血等；（3）骨骼肌疾病多發(fā)性肌炎、肌營(yíng)養(yǎng)不良等。2.一些藥物和毒物可引起ALT活性升高