第八章

掃描電鏡的生物樣品制備技術

一、SEM生物樣品制備的基本要求生物樣品與金屬、礦物等材料不同，它具有質地柔軟、容易變形、導電性能差、二次電子發射率低以及含水量多(有的含水可達80％以上)等特點。因此，在對于高真空狀態下的生物樣品做掃描電鏡觀察時，必須嚴格地遵循一定的原則和操作程序，對樣品進行必要的處理。針對生物樣品的特殊性，在進行SEM樣品制備時，一般應掌握以下原則：

(一)每一操作過程，都應注意防止對樣品的污染和損傷，使被觀察的樣品盡可能地保持原有的外貌及微細結構。(二)去除樣品內水份，以利于維持SEM的真空度和防止對鏡筒的污染。但在脫水和干燥處理時，要盡量減少和避免樣品體積變小及收縮變形等人工損傷。(三)降低樣品表面的電阻率，增加樣品的導電性能，以提高二次電子發射率，建立適當的反差和減少樣品的充放電效應。(四)無論觀察組織細胞的表面或內部微細構造，都應注意確認和保護樣品的觀察面。1.取材前應作好藥品及器材準備。每次取材的品種及數量不宜過多，以免延誤時間、影響制樣效果。2.取材部位要準確，取樣大小要適當。以觀察組織細胞表面結構為主的樣品可以大一些，其直徑最大不宜超過5mm，高度可在3～5mm之間。以觀察組織細胞內部結構為主的樣品，其直徑應小于2mm，高度可在3mm左右。為了提高固定，脫水、干燥及鍍膜效果，在滿足所需要觀察內容的條件下，樣品塊以盡量小一些為宜。3.為了使被觀察的樣品更近于活體狀態，材料應盡量新鮮。取材用的刀片要鋒利，操作要輕巧敏捷，嚴防對樣品的擠壓損傷，同時應作好對樣品觀察面的標記。(二)樣品的清洗

SEM觀察，對樣品表面的清潔要求十分嚴格，在樣品制備過程中，應始終注意清除覆蓋于樣品表面的粘液、分泌物、組織液、血液、細胞碎片及藥物反應沉淀物等所造成的污染，否則不僅會掩蓋樣品表面的微細結構，甚至會得出錯誤的結果和判斷。1.清洗液的選擇

清洗時應根據不同的樣品和要求，選用適當的清洗液：(1)對于貼附于一般組織表面的血液、粘液和其他分泌物，可選用等滲的生理鹽水、5％碳酸鈉溶液或與固定液相應的緩沖液進行沖洗。(2)游離細胞如精子、血細胞等，以及處于懸浮液中的微生物、寄生蟲等細小的樣品，可選用緩沖液或等滲溶液進行清洗。(3)組織培養細胞的清洗，一般選用相應的組織培養液為宜。(4)某些特殊樣品則需針對性地選用一些特殊的清洗液，才能取得滿意的清洗效果。(5)一般樣品固定后的清洗，大都選用相應的緩沖液，但在制樣過程中，每更換一次試劑，為了消除可能出現于樣品表面的反應沉淀物，均需用雙重蒸餾水進行充分清洗。

2、清洗的方法

(1)比較干凈的組織可在固定后清洗，其具體方法是：將樣品放入干燥的玻璃小瓶內，倒入足夠量的清洗液(最少為樣品體積的20倍)，按一定方向輕輕搖動小瓶，并反復更換新清洗液，以達到充分清洗的目的。(2）表面覆蓋大量粘液和雜質的樣品，宜在固定前清洗。為了提高清洗速度和效果，對一些粘著雜質多而緊密的樣品，可利用振蕩器進行清洗或用注射器(或噴射瓶)加壓沖洗。清洗所用的時間，可根據樣品附著物的情況而定。

3.清洗時的注意事項(1)在選擇清洗液時，要使其氫離子濃度(pH值)、滲透壓及清洗液的溫度，盡量符合組織細胞處于活體狀態時的生理條件，以免引起樣品的收縮或膨脹變形及其他人工損傷性變化。(2)往容器內添加和更換清洗液時，應沿瓶壁緩緩滴加，移動樣品時，要采用牙簽貼附法，以避免強力沖擊和夾持樣品可能出現的損傷。需用噴射、超聲或作用較強的溶劑清洗樣品時，要嚴格控制強度和時間，密切觀察樣品的變化。(3)在清洗換液過程中，應把時間安排緊湊，使樣品始終保持濕潤，嚴防發生空氣干燥，造成標本的皺縮塌陷。(1)戊二醛一般配制濃度為1～4％，常用濃度為2.5％(pH7.2～7.4)。戊二醛固定劑特點是穿透力比較強，性能比較穩定，可凝固組織細胞中的蛋白成分，有利于組織堅硬，適用于較大的生物樣品及器官灌流固定，應用普遍。醛類固定劑的缺點是不能增加樣品的二次電子發射率，而對某些標本的穿透固定作用比較緩慢。(2)四氧化鋨一般配制濃度為0.5～2％，常用濃度為0.5～1.0％(pH7.2～7.4)。四氧化鋨對糖元以外的所有細胞成分幾乎都有凝固作用，是進行超微結構研究的理想固定劑之一。四氧化鋨屬重金屬鹽類，其鋨分子可以保留在固定后的細胞結構成分上，具有增加電子反差(電子染色)作用，所以可提高樣品的二次電子發射率和減少樣品的充放電效應。其缺點是易氧化，價格昂貴，而且其蒸氣對操作者的粘膜也有一定固定損傷作用。(3)其它固定劑甲醛(福爾馬林)、多聚甲醛、高錳酸鉀(KMnO4)等亦可作為SEM樣品的固定劑，但使用較少。

3．固定時的注意事項

(1)固定時放置樣品的玻璃容器必須經過凈化和干燥處理，以防止污染或產生其他化學反應。(2)固定劑的液體量要充分，每一容器內所固定的樣品數量要少，固定期間要間斷輕晃容器，以保證樣品得到充分固定。(3)固定液配制后需存入4℃冰箱內，但最好不要久存，使用前應測其pH值，使其符合固定要求。若固定液偏酸，則會降低固定效果并可導致細胞出現損傷性變化。(四)脫水由于SEM樣品塊比透射電鏡樣品塊要大的多，所以SEM樣品的脫水處理，對于保證金屬鍍膜裝置和SEM鏡筒的真空度，防止樣品在高真空狀態下的損傷變形等方面，都有著重要意義。SEM樣品所選用的脫水劑和脫水操作程序，與透射電鏡樣品基本相同，即用不同濃度的乙醇或丙酮，采取所謂“梯度脫水法”逐步取代樣品中的水分。脫水劑的濃度由低至高，依次為30％、50％、70％、80％、90％、100％(二次)。樣品在每一級濃度停留時間為15～30分鐘。如果樣品塊較小，則脫水時間相應縮短；若樣品為單層細胞，其每步脫水時間可縮為3～5分鐘。在脫水過程中，亦應防止樣品暴露于空氣中，發生干燥變形等問題。(五)樣品的干燥處理

盡管SEM生物樣品經脫水后，所含水分可被脫水劑取代，但在樣品內卻含有脫水溶劑甚至殘留少量水分，仍不符合SEM高真空條件的要求，特別是樣品表面溶劑及殘留水分所形成的表面張力，在高真空狀態下會導致表面結構的嚴重破壞，所以經脫水后的樣品，仍需進一步干燥處理，此為SEM樣品制備的成敗關鍵。一般常用的樣品干燥法，主要有以下幾種：1．空氣干燥法(自然干燥法)這是一種最簡便而比較原始的干燥法，將經過常規固定的樣品，放入低表面張力的液體(如乙醇、丙酮、乙醚、環氧丙烷、氧化丙烯等)內，采用梯度法置換出樣品中的水分，然后再把樣品放在空氣中讓樣品所含溶劑自然揮發。由于這些溶劑具有低表面張力的特點，因此在揮發過程中既不致過分的收縮及損傷樣品，又能達到干燥的目的。不過與其它干燥法相比，自然干燥法仍會使許多樣品發生變形收縮，故本法只適用于比較堅硬、或具有鱗片及含水分較少的生物樣品。2．真空干燥法

本法系將經過固定脫水的樣品，直接放入真空鍍膜儀內，在低真空狀態下使樣品內的溶液逐漸揮發，當達到高真空時樣品即可干燥；接著便對樣品進行金屬鍍膜，最后送SEM觀察。盡管本法簡單易行，但由于在真空干燥過程中，樣品表面仍受到一定的表面張力影響，因而仍難于避免一定程度的人為假象。現在只是在缺少其它先進干燥手段時，才考慮選用。3．冷凍干燥法

是將未處理的新鮮樣品或僅作固定及脫水處理的標本，迅速投入液氮或其它驟冷劑(氟利昂12、氟利昂22等)中，使樣品快速冷凍，而后將樣品移入真空鍍膜儀內，讓樣品中已結為冰的“水分”及其溶劑，在高真空狀態下升華，樣品亦隨之得到干燥。由于在升華過程中，組織內液體由固態直接轉為氣態，因此不存在氣相與液相之間的表面張力問題，故對樣品損傷較小。但冷凍干燥法存在著費時間(有時達數小時或幾十小時)、需要特殊的低溫條件、易出現冰晶損傷等缺點，因而影響了推廣應用。當代在SEM設計時，有的儀器已裝有樣品冷凍裝置，可在電鏡內完成冷凍、干燥、金屬鍍膜等處理程序，給操作人員帶來很大的方便，而且樣品損傷也小。4．臨界點干燥法(criticalpointdryingmethod，簡稱CPD法)這是目前認為既可靠而又理想的樣品干燥法。國內外均有定型商品儀器(臨界點干燥器)出售，已被廣泛推廣使用。

(1)簡明工作原理

空氣干燥法中提出，為防止脫水液揮發時，樣品因表面張力的變化而收縮，需要使用表面張力低的溶劑脫水。用臨界點干燥器可以基本上消除表面張力的影響。眾所周知，溫度升高使液體變成氣體，容積增大揮發出去。但在密閉的容器中，氣體不能溢出而壓力增大；氣體與液體混在；氣體密度可增大到和液體一樣；氣相與液相的界面消失；液體的表面張力將不復存在。這種氣液難分的狀態就稱為臨界狀態。此時的溫度和壓力即臨界溫度和臨界壓力。適時打開密閉的容器排出氣體，這會比空氣干燥時的逐漸揮發要快得多，特別是不再受表面張力的影響，這樣就消減了使樣品收縮的危害。

（3）臨界點干燥的操作程序①樣品預處理；包括取材、固定、脫水、中間液置換(醋酸異戊酯15～30分鐘)。②放置樣品：把經過處理的樣品放入不銹鋼樣品籃內，而后將此籃放進臨界點干燥器高壓樣品室，并旋緊室蓋。③注入液體CO2：打開干燥器進氣閥門，使CO2進入樣品室約占70～80％空間，然后關閉貯液鋼瓶和進氣閥門。④CO2置換：將樣品室的溫度控制鈕調至20℃，室內壓力60～70kg／cm2，持續15～20分鐘，使樣品中的醋酸異戊酯被液態CO2所置換。⑤臨界處理：使樣品室的溫度升高至40℃，室內壓力110kg／cm2以上，持續15～20分鐘后，打開放氣閥門，緩緩放出氣體CO2(100～500ml／min)。當氣壓下降至零后，打開室蓋．取出樣品，此時的樣品呈完全干燥狀態。臨界點干燥的注意事項

①放置樣品以前，要對進液管道及樣品室作冷卻處理，以避免液體CO2過早氣化而影響干燥效果。具體作法是：放好樣品室蓋，打開閥門，放入液體CO2，每次2—3秒，反復多次沖洗，使樣品室溫度降至5一10℃，隨后即可放置樣品。②保證液體CO2純度，用乙醇或丙酮清洗管道及樣品室，嚴防對樣品的污染。③樣品籃的頂部及底都要墊好過濾紙，每次裝樣不宜過多，以免影響干燥效果。④放取樣品動作要輕，防止鉗夾損傷。⑤嚴格控制溫度、壓力、時間等操作條件，嚴守操作規程。⑥如有條件可用干冰(固體CO2)代替液體CO2，二者方法步驟基本相同。但省去了CO2鋼瓶，并具有容易控制、不易污染且有利于微小樣品的干燥等優點。SEM樣品的粘膠與安置，是一項需要認真細致操作的重要步驟，在操作過程中，應注意：1)安放樣品以前，確實認準樣品的觀察面，要保證觀察面向上，以免因錯位而造成樣品的毀壞；2)經過脫水和干燥處理后的樣品，具有脆而易碎的特點，故在膠粘時必須動作輕柔，安放準確，防止粗暴或反復夾持樣品；(七)樣品的導電處理生物樣品、特別是經過干燥處理的樣品，其導電性能很差，當接受電子束照射時，極易造成電子的堆積，在顯示熒光屏上出現忽明忽暗、圖像模糊不清等現象。人們把上述情況稱為放電效應。此外，生物樣品元素成分中的原子系數大都較低，因此不僅二次電子的發射率低，而且不能耐受電子轟擊，這樣就難以得到反差適當的理想圖像。鑒于上述情況，為了增強生物樣品的導電性能，提高二次電子發射率及耐受電子轟擊的能力，必須對樣品進行增加導電性能的技術性處理。目前，對生物樣品的導電處理，主要包括金屬鍍膜法和組織導電技術(非鍍膜法)兩大類。

②離子鍍膜的技術要求A.確實作好樣品的預處理：樣品在離子鍍膜之前，必須進行嚴格的脫水、干燥等前處理。若樣品干燥不充分，金屬離子不僅不能很好附著，反而會損傷樣品，特別是能放出內含的有機氣體，這些有機氣體受電離而分解，會給樣品帶來“黑化污染”。經過臨界點干燥的樣品，如果樣品內尚殘留醋酸異戊酯時，則需經較長時間的抽氣才能加高壓。當加高壓時，若出現樣品被白色光柱包圍的現象，應停掉高壓繼續抽氣，嚴重者要對樣品重行臨界點干燥。

B.控制離子濺射條件：樣品要放在金屬靶極的正下方，不要超過陽極板面積的80％，樣品的數目雖不限，但其總面積應控制在靶極面積的三分之一以內。C.防止濺射鍍膜對生物樣品的損傷：在濺射鍍膜時，非導電樣品位于輝光放電的光柱之中，飛向樣品(陽極)的電子流可使其帶有負電荷。部分陽離子亦會被吸過來。這樣，樣品在交錯下來的陽離子和電子的沖擊下，容易受到損傷。如果在鍍膜之前，使樣品稍具一定的導電性(如采用餓酸固定，單寧酸導電染色以及樣品噴炭等方法)，便可起到減少離子的沖擊，防止樣品損傷的作用。小結生物樣品制備的一般程序：

取材固定清洗脫水干燥粘樣及導電處理上鏡觀察②粉末樣品的固定

可以直接固定在導電膠帶或者液體導電膠上，注意點：如果是導電膠帶，揭下來的剝離紙一定要倒著放，撒完樣品后在用剝離紙干凈的面壓一下，固定的才會牢；

如果是液體導電膠，最好是用水溶性的，不容易和樣品發生反應，撒樣品的時間點控制在導電膠快干的時候撒，才能使樣品達到半浸沒狀態。也可以用分散法，見圖③

截面樣品制作

如果是硅片或者是玻璃，需要用到玻璃刀，注意點：用玻璃刀劃的時候要讓開觀察的面，也就是說可以上面和下面各劃一下，然后再掰就可以了

根據不同樣品材質，有的時候是正面掰好，有的時候是從背面掰好對于薄膜類的樣品，可以用液氮粹斷，第九章

其他電鏡技術

電鏡細胞化學技術是將細胞化學和電鏡技術相結合用于細胞組織學研究的一項技術，亦稱為電鏡組織化學技術。它是普通光鏡組織化學技術在電鏡水平上的發展和應用，使組織化學研究從顯微結構水平發展到超顯微結構水平。目前，了解細胞微細結構的生物化學功能的方法，大體可分兩類，一類是將組織細胞分為許多亞細胞成分，在研究這些成分的生化活性的同時，用電鏡進行純形態的觀察，再將生化活性的研究與微細結構的觀察間接地聯系起來；另一類是在盡量保存細胞超微結構的同時，在原位直接將生物化學的反應在電鏡下顯示出來，從而將結構與功能的研究直接結合起來。后者即電鏡細胞化學技術，主要用于各種生化物質尤其是酶的細胞內定位，其次為核酸（DNA和RNA）、脂肪、碳水化合物及某些無機離子的定位。第一節

電子顯微鏡的細胞化學技術酶的細胞化學技術

基本原理在一定的組織細胞內存在著某些特定的酶，而各種酶又都有各自的特定位置，因此，細胞內酶的定位因酶種類不同而異。在一定的反應條件下,使細胞內的酶與底物發生特異性的反應，最終在酶的活性部位上產生一種不溶性的電子致密沉淀物，用電鏡觀察辨別確定該種酶在細胞超微結構中所存在部位。酶與底物反應越特異，越能準備地顯示酶的存在及其位置。電鏡細胞化學是將細胞化學和電鏡技術相結合的一項技術，是光學顯微鏡組織化學基礎上的延伸與發展。該技術是將特定反應產物形成電子散射力強的不溶性沉淀物，借助電鏡做超微結構的原位分析。由于細胞內酶分布和細胞超微結構二者密切結合，從而為探討細胞的生理和病理狀態提供了科學依據。此法無需對酶進行提取和分離，就能獲得組織或細胞內有關代謝的大量信息，因此能將超微結構與功能反應有機地結合起來。目前，用該技術檢出的酶大約有80種，近40種可進行超微結構定位。酶的電鏡細胞化學技術大致操作步驟為：化學固定或冷凍切片、溫育、鋨化、脫水、樹脂包埋、超薄切片、電子染色、電鏡觀察等。第二節

免疫電子顯微鏡技術

免疫電鏡技術是免疫學和電鏡技術的結合。該技術將免疫學中抗原抗體反應的特異性與組織化學中形態的可見性，結合電鏡的高分辨能力和放大本領，在超微結構和分子水平上研究各組織器官細胞的形態和功能，細菌、病毒等病原物的形態、結構和性質，還可進行細胞內抗原的定性定位研究，從而將細胞亞顯微結構與其機能代謝、形態等各方面研究緊密結合起來。目前免疫電鏡主要分為有標記物和無標記物兩大類。無標記物類的常用方法為抗原抗體直接作用后形成的免疫復合物的電鏡觀察。有標記物類，首先由Singer在1959年建立鐵蛋白(ferritin)標記抗體技術；由Nakane和Pierce在1968年建立酶標記抗體技術；由Faulk和Taylor在1971年建立膠體金標記技術。此外，還有雜交抗體技術(Hybridantibodymethod)和鐵蛋白抗鐵蛋白復合物技術(鐵蛋白抗體法)及凝集素(Lectin)電鏡標記技術等。

免疫電鏡技術的應用基本上可分兩大類。第一，研究懸浮態的抗原（細菌、病毒、激素、酶等），確定其形態及大小，依據是否與所用抗血清發生特異性結合反應，確定其抗原的血清學特性，如病毒、細菌的種、株系、菌系的特異性，也可用于研究抗原的表面結構，如細菌的鞭毛、菌毛、菌體特性，及對細胞表面的抗原作定性定位研究。第二，對組織細胞內的抗原作定位定性研究，通過標記抗體與抗原的直接或間接作用，結合超微結構的觀察，對細胞內的抗原（細菌、病毒、激素等）作定性定位研究是病理學、生理學、免疫學等學科的研究課題，其中免疫鐵蛋白、免疫酶、免疫膠體金均可用于這方面的研究。免疫膠體金技術的應用中包括用不同大小的金顆粒標記免疫球蛋白對同一細胞內不同抗原進行雙重和多重免疫標記。免疫電鏡技術能否取得好的結果，關鍵在于保存好組織結構及組織抗原的抗原性、原位性和可接近性。在免疫電鏡技術中，要避免使用四氧化鋨，以防止抗原性的喪失。然而，除上述使用合適的固定液保存抗原性外，在免疫電鏡技術中最為有效的方法是冷凍超薄切片，其制作需要特殊的設備一冷凍超薄切片機.

膠體金標記技術的發展1939年，Kauschehe和Ruska對蛋白質吸附于膠體金的形態學做了探討，用金顆粒標記的煙草花葉病毒電子顯微圖加以證明。1962年，Feldherr和Marshal把膠體金顆粒當作示蹤物用于電子顯微鏡研究。1971年，Faulk和Taylor提出膠體金可作為抗血清的特異標記物用于透射電子顯微鏡。他們把兔抗沙門氏菌抗血清吸附到膠體金顆粒上，通過孵育獲得細菌表面的特異性標記，這種方法稱為直接標記。1974－1975年，委內瑞拉Romano及其同事首次制備出蛋白質A－金復合物，并用于包埋前標記。同年，瑞士Horisberger將該方法用于掃描電子顯微鏡。1977年Horisberger及其同事建立了制備免疫球蛋白－金顆粒的基本方法。

在免疫電鏡中，目前最常用的標記物是膠體金。膠體金標記抗體技術是20世紀70年代發展起來的一種新技術，有十分廣泛的應用前景。包埋前標記，即先在未經包埋的組織厚切片上進行免疫標記。實驗步驟是：組織經醛類固定劑輕微固定后，用振動切片機切幾十微米的厚切片，在切片上進行免疫標記后，再用鋨酸后固定、環氧樹脂包埋，得到超薄切片后在電鏡下檢測抗原和抗體結合位置。包埋前免疫標記可使樣品在標記期間抗原性得到良好保存。但是，該方法只能定位細胞表面抗原位置，而不能定位細胞內抗原位置。包埋后標記，即組織包埋后，得到超薄切片才進行免疫標記。實驗步驟是：組織經醛類固定劑輕微固定后進行包埋，在超薄切片上進行免疫標記，最后在電鏡下檢測抗原和抗體的特異結合。包埋后標記雖然可使抗原在超微結構水平上得到精細定位，但也存在一些問題，如在樣品制備過程中，因抗原性會有不同程度降低或丟失，而影響標記效果。隨著膠體金技術的不斷發展，研究者還將其與冷凍切片、冷凍斷裂等技術配合，得到令人滿意的實驗結果。結合冷凍斷裂技術，可將斷裂后暴露的膜結構進行免疫標記，根據標記結果得知每一半膜膜組分的分布與分配情況。結合冷凍切片技術的免疫標記，因組織通過快速冷凍和冷凍超薄切片后進行免疫標記，故能較好的保存組織抗原性而得到較理想的標記效果。用于免疫電鏡樣品制備的包埋劑LowicryK4M、LRWhite自1981年步入市場以來得到廣泛應用。環氧樹脂Epon812或SPurr有時也用于免疫電鏡樣品制備，但有一點不同的是，當為樣品超微結構而用鋨酸后固定、并用常規方法進行包埋聚合的樣品，在免疫標記前需用過氧化氫對組織切片進行預處理。膠體金標記的優越性利用膠體金的顆粒性和電子致密度較高的特性，可對所標記的對象進行定量研究。在某一區域內，根據金顆粒分布數量可對抗原做精確定位和定量。利用膠體金顆粒大小在制備過程中可人為控制的特點，可用兩種大小不同的金顆粒分別標記兩種不同的抗體。即對同一組織切片進行雙標記，以利于細胞結構與功能的深入研究。綜上所述，膠體金標記抗體技術具有分辨率高，可定量研究所標記對象，對同一組織切片進行雙標記、電鏡下易于檢測等優越性。免疫電鏡樣品的制備在免疫電鏡技術中，影響得到理想標記結果的因素有多種，如樣品制備、抗體應用、免疫標記等。其中樣品制備則較為關鍵。免疫電鏡的樣品制備，有常規和低溫兩種方法。實際工作中，多采用低溫樣品制備技術，而常規方法較為少用。低溫樣品制備技術在低溫樣品制備方法中，樣品經醛類固定劑輕微固定，用丙烯酸類樹脂在低溫下浸透，包埋與聚合。該方法可避免高溫聚合對組織抗原造成的損傷，使抗原性得到保存。包埋介質：丙烯酸類樹脂包括Lowicryl（K4M、K11M、HM20、HM23）、LRWhite、LRGold、GMA和PEG，它們屬于水溶性樹脂，適于低溫包埋，通常用于免疫電鏡樣品制備。水溶性樹脂具有以下特點：與水混溶，可避免有機脫水劑對酶活性的損傷和破壞；有較低熔點，低溫下發生聚合，可避免高溫對組織抗原的破壞；聚合時收縮率小，可減少細胞收縮或膨脹；可使包埋樣品保持良好超微結構，并易于染色。取材與固定固定液：實驗證明，2.5%戊二醛二甲砷酸鹽緩沖液固定的生物組織，細胞的抗原性及超微結構均可得到較好保存。4％多聚甲醛或3％甲醛加0.1％戊二醛也可使組織的固定和抗原的保存得到較好效果，其中4％多聚甲醛使用更為廣泛。脫水與浸透脫水劑通常用甲醇，因甲醇的相對分子質量小，脫水效果較好。脫水時用不同濃度的甲醇在不同溫度下脫水，濃度逐漸加大，溫度逐漸降低。脫水劑與包埋劑按不同比例在－20℃浸透數小時。包埋與聚合LowicrylK4M包埋的樣品聚合時通常需用低溫冰箱和紫外熒光燈。－30℃聚合5～7天，聚合期間需經常調換樣品方位。聚合號的樣品塊需放入避光的盒子里，在－20℃保存。載網處理與超薄切片載網處理載網可用帶方華膜的鎳網或金網。鎳網的清潔處理通常采用20％乙酸溶液超聲處理5～6分鐘，后用90％乙醇和雙蒸水沖洗1-2遍，晾干。超薄切片K4M親水，切片要盡快收集；包埋塊比常規的軟一些，切片速度適當加快。葉綠體中Rubisco主要定位于基質部位第三節共焦顯微術共焦顯微術所用的儀器通常稱為共焦激光掃描顯微鏡，即應用共焦的原理，以激光為光源，用掃描的方式進行工作。八十年代以后，由于有了高強度照明的激光光源、高速掃描技術和高效率的計算機圖像處理系統才使共焦顯微術進入了實用階段。共焦顯微術的基本原理是對樣品的照明光源只聚焦于焦平面的一點，檢測器也只檢測來自這同一點的光(稱為共焦)；掃描技術是將光點在樣品的各點逐點掃描或按同樣方式在整個樣品的不同深度，逐層、逐點掃描；檢測器將掃描信號輸送到計算機圖像處理系統，便可重建整個樣品的清晰圖像。用這種方法記錄的圖像數據系統與現代醫學診斷用計算機斷層(computerizedtomography,CT)所得的數據系統極為相似，也可看做是細胞的CT。共焦顯微術是非浸入性的無損斷層掃描圖像，因此能在活細胞上進行。圖像處理可使樣品的像進行三維重構，重現立體圖像，還可從空間的任何角度觀察其整個結構，并能將多片圖像疊合而獲得一個延伸焦點的圖像。第四節電子顯微鏡的冷凍制樣技術

冷凍制樣技術是一種物理制樣技術，用快速冷凍取代了常規制樣中的化學處理步驟。冷凍制樣技術包括冷凍干燥、冷凍取代、冷凍超薄切片和冷凍斷裂（蝕刻）復型技術等。這類技術的共同特點是：1．對樣品采取快速冷凍固定并使之硬化，保持了細胞或組織的生活狀態，對某些生物還能保持原始形態特征和生物活性。2．透射電鏡或掃描電鏡的常規樣品制備中都需要使用固定劑、脫水劑、置換劑等化學試劑，無論化學方法的原理和操作多完美和嚴格，總要引起樣品成分和形貌變化，甚至抗原性、酶活性的喪失。冷凍制樣技術不采用化學固定劑和有機溶劑脫水劑等一系列化學試劑處理，使細胞或組織中的生物大分子、酶和其他化學成分都得以保持在更接近其生命狀態，并且避免了處理過程中樣品內殘留化學物質的可能）因此對于組織化學、細胞免疫化學、放射自顯影和X射線微區分析都是較理想的制樣方法。3．冷凍技術與常規制樣過程相比，操作步驟少，時間短，適用于快速研究和診斷。盡管冷凍技術難度大、成本高，但仍得到廣泛應用和發展，已經在形態學、組織化學、免疫化學等生物學各領域甚至橡膠、塑料及其他高分子材料的研究中成為具有特殊意義先進的手段。Cryo-SEM技術原理及操作步驟簡介Cryo-SEM原理及操作步驟：

濕樣品-快速預冷(玻璃態水)-傳輸-冷凍制樣(斷裂、刻蝕、鍍膜)-傳輸-

電鏡觀察Cryo-SEM系統遵循的設計原則：全程真空、全程冷凍樣品可直接在完全含水狀態下觀察可溶材料被保留沒有或很少發生可彌漫物質的再分布很少或沒有機械損傷通常無需（暴露到）有毒試劑對樣品進行動態實驗的最佳方法快速過程高分辨率能力通過低溫斷裂獲得額外信息;通過升華刻蝕顯示內在信息適合液體、半液體，泡沫及電子束敏感的樣品具有“重做”樣品的能力(例如：重新斷裂及鍍膜)Cryo-SEM與常規干燥處理比較優勢簡介Cryo-SEM與LV,EP,ESEM比較優勢簡介盡管LV,EP,ESEM等系統采用了安裝皮特電制冷冷臺、降低真空度和向SEM導入水蒸氣等辦法，樣品水分丟失問題仍沒有徹底避免；且常以犧牲分辨率為代價。Cryo-SEM冷凍系統是防止樣品脫水失真的最佳解決方案Cryo系統可做冷凍斷裂以便獲得額外信息Cryo系統可做升華刻蝕（選擇性除水）以便揭示內在信息Cryo系統解決了液體及易受電子束損傷材料電鏡成像問題Cryo系統允許樣品鍍膜以進行高分辨率成像Cryo系統可對動態事件樣品進行觀察研究以探索動態規律Cryo系統與LV,EP,ESEM配套，可進行原位觀察Cryo系統還可與HPPF技術對接；總之應用范圍和手段更寬冷凍掃描法處理的樣品直接在完全含水狀態下觀察,圖為固體水的冰晶照片Cryo-SEM用途:

完全含水樣品Bar:200um(inset100um)

Foamedalbumin(eggwhite)蛋白泡沫PP2000:specialholderforliquids

液體專用樣品夾Cryo-SEM用途:

液體、半液體和泡沫樣品Cryo-SEM:

K1250X安裝實例K1250XwithFEIXL40Z：肌纖維Z帶

箭頭：T管（橫小管）Ratmyocardium(heartmuscle)大鼠心肌Cryo-SEM:

動物學應用Zymogengranules

胰腺的酶原粒

Cryo-SEM:

動物學應用Roothairswithassociatedwater(ice).Thiscouldberemovedbysublimation(etching)ifneeded

帶有締合水(冰)的植物根毛

Cryo-SEM:

植物學應用食蟲植物_阿帝露花(茅膏菜),分泌粘液的觸須Cryo-SEM:

植物學應用與植物根系互惠共生的菌根真菌17000X8000X4000XCryo-SEM:

菌藻、微生物、細胞研究第五節金屬投影和復型技術

金屬投影技術和復型技術的共同特點是采用真空噴鍍儀將某些重金屬物質加熱到熔點以上，形成極細小的顆粒投射到樣品上，產生電子反差。一、金屬投影技術金屬投影技術是1946年由Willams和Wgckoff首先建立的一種樣品制備方法。目前，主要用于微顆粒狀生物樣品，如細菌、病毒、原生動物、孢子、分離的微纖絲、蛋白質分子、核酸分子，以及其他各種非生物的微粒和粉末材料。由于受到投影金屬材料顆粒度的限制，其分辨率不很高，尤其是對于病毒等極小的顆粒樣品，現已經被負染色技術所取代。對于某些不適宜作負染色的樣品，采用金屬投影來增加反差仍是唯一的途徑。另外，它還可用于測量顆粒大小和高度：增大顆粒尺寸，以改善電鏡下的可見性，如核酸分子的觀察；增加掃描電鏡樣品表面導電性，投影技術還是制備復型、冷凍蝕刻復型等技術的基礎。（一）金屬投影的原理將一些高原子序數、分子量和熔點高的金屬或合金，置于高真空中加熱到熔化狀態，金屬即蒸發，成為極細小的顆粒向四周直線噴射，這種現象稱為“真空蒸發”。蒸發的金屬顆粒沉積到真空室中的樣品上，會在樣品表面形成一層薄膜，這就是“真空鍍膜”。如果讓蒸發的金屬顆粒以一定的角度投射到樣品上，在面向蒸發源的部位就會沉積較多的金屬，而背向蒸發源的部位則沉積較少甚至沒有金屬沉積。樣品顆粒具有一定的高度，能遮擋直線投射的金屬顆粒，在樣品背向蒸發源的一側將形成無金屬沉積的投影區。有金屬沉積的部位散射電子能力強，透射電鏡下呈現為暗區，無金屬沉積的樣品背面及投影區散射電子的能力弱，電鏡下呈現為亮區，整個圖像由于投影效果，反差得到了加強并具有豐富的立體感。（二）真空噴鍍儀真空噴鍍儀是電鏡實驗室必備的常規設備之一，進行金屬投影，制備復型、碳膜，以及掃描電鏡樣品的表面導電處理，都需要用到該儀器。它主要由真空系統和蒸發裝置兩部分組成，真空系統工作原理及過程與電鏡的真空系統相類似。蒸發裝置安裝在真空室內，共有兩組電極，一組作碳蒸發用，另一組作金屬蒸發用。（三）金屬投影的方法1．一次投影2．二次投影和旋轉投影在一次投影的基礎上，又發展了二次投影、多次投影以及旋轉投影方法，這些方法適用于分辨要求較高的樣品。二、復型技術復型技術與金屬投影技術有著密切的關系，在掃描電鏡實用化之前，復型法是唯一的一種能用透射電鏡觀察樣品表面結構的制樣方法。復型法多用于金屬材料、礦物、化合物的表面研究，也可用于某些生物材料如骨胳、牙齒、植物的種子、孢子、花粉、木材等研究。自從掃描電鏡出現后，一般觀察樣品的表面形貌都可以直接用掃描電鏡而很少采用復型方法，但對于某些體積大又不易分割、不易作前處理或易受電子束損傷的樣品，用復型法仍有其獨特之處。復型法的另一大優點是由于用透射電鏡觀察復型，其分辨率比掃描電鏡高得多。此外，冷凍蝕刻復型也屬于復型方法，但有其特殊性和突出優點。

復型的原理采用一種電子透明的薄膜將某些堅硬材料的表面結構“鑄印”下來，復制的這層薄膜就相當于表面結構的一個“模子”，稱之為“復型”。結合金屬投影技術，可以增強復型膜的電子反差，在透射電鏡下觀察復型膜，能了解原來樣品的天然表面或人工斷面的細微結構特征。復型技術的特點是制樣簡便，不損傷樣品，圖像具有很好的立體感，利用透射電鏡就可觀察物體的表面形貌。

第六節生物大分子電子顯微鏡技術

生物大分子主要包括蛋白質、核酸、多糖和脂類四類物質。它們以各種形式參與活細胞的生命活動，在生物體中起著十分重要的作用。因此研究這些分子的大小、形狀、空間結構以及各種存在狀態，對于了解其功能和在整個生命活動中的變化都具有重要意義。目前，研究生物大分子主要采用兩種方法，即用多種物理和化學的方法測定其理化特性；運用電子顯微鏡和X射線衍射技術觀察分析其形態及空間結構。X射線衍射技術在蛋白質結構研究方面雖然分辨率高達1?，但只適用于能制成結晶體的樣品，局限性較大，而電鏡觀察的方法則比較簡便，結果直觀可靠，目前已經取得了許多有價值的進展，分辨率高，達到7?。盡管當前生物大分子技術還不能看到大分子中的原子排列情況，但隨著各種制樣手段的改進，新的儀器和方法的出現，用電鏡研究生物大分子的工作，必然會得到極大的改進和提高。應用生物大分子電鏡技術研究最多的是蛋白質（包括各種酶）和核酸兩大類物質。第七節X-ary能譜分析儀就生物學應用來說，目前常見的X射線顯微分析系統有分析電鏡、透射電鏡加X射線顯微分析裝置、掃描電鏡加X射線顯微分析裝置、掃描透射電鏡加X射線顯微分析裝置，以及專門設計的電子探針等。一個待測元素的特征X射線，總是與同時被激發產生的連續X射線以及樣品內存在的其他元素的特征X射線一起，從被入射電子轟擊的樣品區域內被激發出來。X射線能譜分析儀必須解決的關鍵問題就是從這些具有各種能量的X射線中，把待測元素的特征譜線（Kα、Lα或Mα）辨認出來并加以收集，繼而對其能量強度及數量進行分析，測算樣品內所含元素成分及含量。XL-30ESEM配備的能譜儀abcdea.打印機b.顯示器c.MP處理器d.能譜處理器e.計算機

X-ary能譜處理系統

X射線能譜儀主要由電子光學系統（電鏡）和檢測系統所組成。電子光學系統功能是產生一個被聚焦得很細的電子束和提供樣品的圖像，同時產生樣品中元素的特征X射線。檢測系統由X射線檢測器、能譜處理器、計算機和顯示記錄系統所組成如圖。X射線檢測器采用高效率鋰漂移硅固態半導體檢測器，習慣上記作Si（Li）檢測器，它可在觀察圖像的條件下，有效地檢測由試樣發出的特征X射線。能譜分析的主要過程是：高能入射電子束從分析試樣上激發出的特征X射線照射在Si（Li）檢測器上時，使Si原子電離，產生電子一空穴對；在電場作用下，電子一空穴對能放電而產生與入射X射線光子能量成正比的電荷脈沖信號。由于每產生一對電子一空穴對所需要的能量是恒定的，在理想情況下，一定波長的X射線產生的電子一空穴對的數目與X射線的能量直接相關。能量高的X射線產生的電子一空穴對數目多，產生的電荷脈沖也高。然后，信號放大系統將輸入的電荷脈沖轉變成放大的電壓，如利用薄樣品，在最好條件下空間分辨率可達30nm或更好，這就可以分析如線粒體中濃密的顆粒狀物。

X射線能譜儀的主要特點：（1）能譜儀可在幾分鐘內對B5～U92之間的所有元素進行快速定性分析。因為它能同時接收和檢測所有不同能量的X射線光子信號，進一步的能量鑒別由電子光學線路進行，數據可以方便地貯存或取用。（2）能譜儀Si（Li）檢測器對能量范圍內的X-ary光子檢測效率很高，可適應低入射電子束流（10－11A）條件的工作。

(3)不損傷樣品；

(4)快，不需對樣品特殊處理；

(5)準確反映元素在微區內的分布(MAP)情況；

X射線能譜儀的主要缺點

1、不能精確定量；

2、痕量微量不確反映；

3、Z<5的元素不能分析，5<Z<8的元素誤差較大；能譜分析方法及應用一、樣品的制備1．生物的硬組織：對于牙齒、骨骼、結石及木材等生物硬組織進行定性分析時，首先應對樣品表面進行清潔，然后經干燥除去水分，在真空中噴鍍金或碳，噴鍍層厚度約20～40?較為適宜。也可在環掃或低真空下不要噴鍍，直接觀察和分析。2．生物軟組織（1）空氣干燥法：把懸浮液中的樣品如血球、培養細胞、微生物等，用涂片、離心或噴霧法安裝到適當支持物上，然后進行空氣干燥。該方法比較簡單，但也只能用于粗略的細胞水平分析，在真空中噴鍍金或碳。也可在環掃或低真空下直接觀察和分析。（3）冷凍干燥法：這是目前制備X射線顯微分析樣品最好的方法，冷凍法保存了細胞中各種可溶性物質和電解質，可以維持細胞質的化學物質在三維結構上分布的不連續性，從而進行有效的元素分布的研究。二、分析方法

X射線顯微分析有三種基本的工作方式：點分析；線分析；面分析?，F代能譜儀能一次性采集一幅圖中不同區域的信號，貯存后，隨時對不同點、線、面所有元素進行分析。三、應用

X射線顯微分析技術在生物學方面的應用，早期僅對牙齒、骨骼、木材、葉和根等硬樣品中含有的元素進行了一些探測和分析，取得一些成果。從上世紀60年代開始，一些科學工作者利用該項技術解決了一些生物學問題，從而使其在生物學的研究中得到了初步應用，然而由于該技術的理論和方法的水平所限，在當時應用還不廣泛。該技術進入上世紀未，分析理論和方法的發展，尤其是定量分析技術的改進，以及適合于該項技術的樣品制備技術（特別是低溫制樣技術）的發展，使得X射線顯微分析技術在技術生物學研究中的應用得到了蓬勃發展。臨床電鏡快速檢測病毒技術

微波輻射制樣微波輻射制樣方法是將生物樣品的固定、脫水、浸透、包埋、染色等操作均在微波爐中進行,予以一定“火力”和時間的微波輻射，從而加速制樣過程。(1)微波輻射制樣技術的原理:微波是一種非電離輻射的電磁波，其波長在1mm至1m之間，用頻率為2450MHz(兆赫茲)。生物樣品中的一些雙