陽離子脂質體對人角膜基質細胞影響的實驗研究

【關鍵詞】

陽離子

【摘要】目的觀測陽離子脂質體LipofectamineTM2000對人角膜基質細胞的影響，探索其應用于人角膜基質細胞的可行性及安全濃度范圍，為人角膜基質細胞的基因治療研究奠定基礎。方法體外培養人角膜基質細胞，取第3～5代細胞鑒定后用于實驗。采用四氮唑鹽代謝法（MTT），檢測不同濃度和作用時間LipofectamineTM2000對培養的人角膜基質細胞增殖的影響;采用0.5%臺盼蘭染色法，檢測脂質體LipofectamineTM2000對培養的人角膜基質細胞存活率的影響與其濃度和作用時間的關系。結果陽離子脂質體LipofectamineTM2000（LF2000）對人角膜基質細胞的影響與濃度和作用時間有關。LF2000在濃度高于一定水平時可以引起細胞增殖和存活率的下降，濃度相同時作用時間越長下降越明顯。LF2000在濃度40μg/ml以下作用24h不會對細胞增殖和存活率產生影響。結論LipofectamineTM2000在一定濃度范圍內不引起細胞毒性。LipofectamineTM2000有望在人角膜基質細胞的基因治療中發揮重要作用。關鍵詞角膜基質細胞基因轉染陽離子脂質體

角膜基質層占全角膜厚度的90%以上，角膜損傷后修復過程中基質細胞的變化，對視功能的恢復極為重要。臨床醫生一直在努力尋找調節角膜損傷愈合反應的藥物，分子和細胞水平藥物治療是目前的研究熱點。本實驗試圖通過利用不同濃度和作用時間陽離子脂質體LipofectamineTM2000作用于體外培養人的角膜基質細胞，探索其濃度范圍及作用時間，旨在為基因預防及治療角膜疾病打下基礎。1材料與方法1.1材料主要儀器:低溫離心機，恒溫箱，細胞培養箱，倒置相差顯微鏡，低速恒溫離心機（Hereus公司）。主要試劑:脂質體LipofectamineTM2000（Gibco/BRL公司），DMEM培養基（Gibco/BRL公司）。1.2方法1.2.1人眼角膜基質細胞的原代培養及傳代培養采用組織塊培養法，將組織碎塊接種于培養瓶壁上，先置入37℃、5%CO2溫箱中4h，待組織塊貼壁微干涸后加入含20%胎牛血清的DMEM/F12培養基適量。培養瓶放入37℃、5%CO2溫箱中培養3～5天換1次培養液。原代基質細胞80%匯合時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。超凈臺內無菌條件下，先吸出培養瓶內舊培養液，用少量D-Hanks漂洗1次。加入0.25%胰蛋白酶少許，置溫箱中3min。在倒置相差顯微鏡下見細胞胞質回縮成圓形，彼此分離并即將離壁，加入20%胎牛血清DMEM培養液終止消失。再加入適量培養基，用吸管吸取培養液輕輕反復吹打，使細胞脫離瓶壁，成為細胞懸液。按1:2分裝細胞懸液后置溫箱中培養，每3天換1次培養液。1.2.2細胞爬片的制備及鑒定超凈臺內無菌條件下，將已消毒的蓋玻片放入6孔培養板中，每孔2片。將第三代融合生長的基質細胞用0.25%胰蛋白酶消化制備細胞懸液。將消化稀釋的細胞懸液滴在蓋玻片上，置入溫箱中培養，常規定時換液;細胞生長至接近融合后，取出蓋玻片，D-Hanks液漂洗后，置入固定液中固定。用第3～5代的人眼角膜基質細胞作成細胞爬片，至50%～60%匯合后取出。D-Hanks液沖洗2次后，置于4℃冷丙酮液中固定15min，D-Hanks沖洗后空氣中自然干燥，置-20℃備用。PBS液洗5min×3次，Tritonx-100洗滌5min，再用PBS洗5min×3次。加0.3%H2O2/甲醇溶液于玻片上，置濕盒內室溫下處理20min，PBS洗5min×3次。加正常血清于玻片上，置濕盒內室溫下20min。小鼠抗人波形蛋白及角蛋白單克隆抗體工作液于玻片上，置濕盒內4℃過夜，PBS洗5min×3次。加生物素化羊抗鼠二抗于玻片上。置濕盒內37℃30min，PBS洗5min×3次。加入HRP（辣根素過氧化物）酶標記的鏈霉親和素工作液，置濕盒內37℃30min，PBS洗5min×3次。AB/H2O2顯色，流水充分洗。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。1.2.3LipofectamineTM2000對人角膜基質細胞的影響MTT測定法觀察LipofectamineTM2000對基質細胞增殖的影響:取第四代基質細胞，用0.25%胰蛋白酶消化制備細胞懸液。調整細胞濃度4×104/ml接種到96孔板內，每孔加入100μl細胞懸液。培養24h，細胞貼壁后，吸去原培養液，各組分別加入濃度為0（陰性對照）、5、10、20、40、80μg/ml的LipofectamineTM2000，每孔100μl，繼續置溫箱培養。每組設復孔5孔，另設5孔空白對照。培養12h或24h后每孔加入5mg/mlMTT10μl，繼續置入溫箱中培養。培養4h后，吸走原液，每孔加入DMSO100μl，室溫靜置5min，搖勻后于酶聯免疫檢測儀檢測各孔550nm波長處的吸光度值（A值）。計算公式為:增殖率=（LipofectamineTM2000組A值/陰性對照組A值）×100%。臺盼蘭染色觀察LipofectamineTM2000對基質細胞存活的影響:細胞接種、分組方法同MTT法。分別在加入LipoˉfectamineTM2000后12h及24h，每組取5孔，小心吸棄培養上清液，滴加一滴0.4%臺盼蘭溶液，立即在倒置相差顯微鏡下觀察。死亡細胞因細胞膜完整性破壞，可被臺盼蘭染成蘭色，而正常細胞染色陰性。分鐘內分別計數每孔5個低倍視野中染色陽性和陰性細胞的數目，取平均值作為統計結果。細胞存活率計算公式:存活率=（臺盼蘭染色陰性細胞數/細胞總數）×100%。1.3統計學方法應用SPSS軟件包，采用t檢驗及方差分析進行均數間差異顯著性比較。2結果2.1人角膜基質細胞的培養及鑒定組織塊接種后第3天，細胞從組織塊邊緣游離出來，單層，貼壁，細胞呈梭性，核圓，居中，細胞傳代后，7天后細胞基本融合生長。細胞爬片行免疫組織化學染色后，在顯微鏡下可見細胞胞漿中均呈灰褐色陽性染色，即波形蛋白染色陽性，而角蛋白染色為陰性，證明所培養細胞確實為角膜基質細胞。2.2LipofectamineTM2000對人角膜基質細胞的影響2.2.1LipofectamineTM2000對人角膜基質細胞增殖和存活率的影響（1）LipofectamineTM2000在濃度20μg/ml下作用24h，對人角膜基質細胞增殖和存活率沒有明顯影響，與陰性對照組均數比較差異無顯著性（P>0.05）;在濃度40μg/ml以上作用24h，則引起細胞增殖和存活率的明顯降低（P<0.05）。（2）LipofectamineTM2000在濃度40μg/ml或80μg/ml下作用24h比作用12h組細胞增殖和存活率高，差異有顯著性（P<0.05）。（3）從表1、2，可以看出人角膜基質細胞增殖率和存活率隨LipofectamineTM2000濃度的增高而呈下降的趨勢。表1不同濃度LF2000對培養的基質細胞增殖率的影響（略）表2不同濃度LF2000對培養的基質細胞存活率的影響（略）3討論正常角膜基質由250層膠原纖維板構成，呈交錯排列，每層纖維板又由許多平行排列、直徑相同的膠原纖維組成。基質區的主要細胞成分為角膜基質細胞，它合成和分泌纖維，并且對其排列和平衡都起作用。角膜創傷和修復過程中基質細胞的變化，對角膜的結構和功能有重要的影響。近年來，人們在研究和控制角膜創傷修復過程方面進行了相當大的努力，但是許多修復過程機制尚待進一步研究。隨著分子生物技術的迅速發展，基因治療作為一種全新的治療手段已日益受到重視。基因轉染技術作為基因治療的基礎，在眼科疾病的診斷和治療的研究中也有廣泛的應用前景［1～3］。其關鍵技術在于能使外源基因進入靶細胞的載體，一個理想的載體應具有能在適當的啟動子控制下將目的基因轉向特定的靶細胞或靶組織、不激發炎癥反應或免疫反應、能夠根據不同治療需求短暫或長期在宿主體內表達、載體應易于構建和純化、高滴度且不會引起插入突變或引發野生型病毒污染［4，5］。為基因治療的載體通常包括有裸體DNA（也稱質粒）、陽離子脂質體及病毒類等［6，7］。裸體DNA轉染效率低，作為生物學方法有病毒載體介導的體內基因轉染效率雖然較高，但由于病毒載體有免疫原性，運用于臨床治療有很大的風險性。脂質體屬于非生物學方法沒有類似病毒載體的安全性問題，方法簡單、免疫原性弱、容量大，比較適用于體內基因治療的途徑，尤其是目前發現的多價陽離子脂質體轉染效率較高［8，9］。從本實驗可由脂質體LipofectamineTM2000在一定濃度范圍及作用時間內，對人角膜基質細胞增殖和存活率沒有明顯影響，可以利用其將某些目的基因轉入角膜基質細胞，從分子水平干預損傷后角膜修復過程，為治療角膜疾病提供一種新的更為有效的方法。

參考文獻1CrystalRG.Transferofgenestohumans:earlylessonsandobstaclestosuccess.Science，1995，270（5235）:404-410.2SinghVK，TripathiP.Gene