醫(yī)學突破的先鋒-CRISPR介導的HeLa細1952年，HenriettaLack(HeLa)細胞成為第一個可以在實驗室中無限傳代的人類細胞系，而這些細胞被科學家們標記為“永生的"。研究人員最初是從侵襲性官頸癌腫瘤中提取出的HeLa細胞。這些細胞在不斷供應的營養(yǎng)物質(zhì)下持續(xù)繁殖，并在不到24小時內(nèi)生產(chǎn)出新一代的細胞。與許多腫瘤一樣，Hela細胞具有錯誤組成的基因組，其中多個染色體有一個或多個拷貝：正常細胞有46條染色體，而Hela細胞包含76至80條染色體，其中一些染色體嚴重突變。同時，這些細胞還表達了過反應性端粒酶，即每次分裂后重建端粒，防止細胞衰老，以允許HeLa細胞無限傳代。HeLa細胞系為許多醫(yī)學突破都做出了貢獻，從研究太空零重力效成和脊髓灰質(zhì)炎疫苗的開發(fā)，到白血病、皿病病毒和癌癥的全球性研究。盡管現(xiàn)在有許多其他細胞系也在使用，但自HeLa細胞被分離以來，HeLa細胞在當今醫(yī)學研究的大多數(shù)領域都取得了一定的進展，尤其是在癌癥生物學，傳染病，基礎微生物學等領域都取得了一些重大進展。涉及HeLa細胞的研究已經(jīng)在超過11000份科學刊物中描述過，其中包括三份獲得過諾貝爾獎的：2008年發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒（HPV）是宮頸癌的致病因子；2009年發(fā)現(xiàn)端粒酶可以保護染色體的端粒，從而防止染色體的降解，和2014年促進在細胞生長方面的實時觀察。這個驚人的數(shù)字清晰地表明這些細胞在過去六十年中對研究的重要性。HeLa細胞的多功能性和強大功能使其成為必不可少的實驗室工具，繼續(xù)為人類健康與疾病的基礎提供新的線索。HeLa細胞是熱門的細胞模型之一，也是生命科學家的工具，去研究疾病或治療活性藥物分子的作用機制，以及破譯細胞信號的傳導，如DNA損傷修復。研究人員選擇HeLa細胞作為多學科研究的工具，因為它具有永生的細胞特征，可適用于多組學數(shù)據(jù)庫（基因組學，蛋白質(zhì)組學，和轉(zhuǎn)錄組學）,并且易于利用這些數(shù)據(jù)庫來設計和改進研究項目。最近的一項研究就是利用HeLa細胞研究SARS-CoV-2病毒在人體中的感染性。研究COVD-19的科學家們使用HeLa細胞以確定病毒用于進入人體細胞的受體。基于對HeLa細胞的研究，新型冠狀病毒的研究取得了前所未有的進展。應用范HeLa細胞已經(jīng)發(fā)展成為研究各種課題的有用模型。源自HPV轉(zhuǎn)化的宮頸腺癌細胞的HeLa細胞已被用于各種研究，包括但不限于癌癥的研究。作為一種腫瘤模型，它們已被廣泛應用于研究中：腫瘤細胞的遷移和侵襲藥物開發(fā)細胞死亡途徑CRISPR-U?基因編輯在HeLa細胞的應用CRISPRCRISPR-Cas系統(tǒng)已經(jīng)成為了革命性的基因組編輯工具，為生命科學的發(fā)展和我們對生命的理解提供了巨大的動力。CRISPR系統(tǒng)用于精確的基因組編輯，可以通過用所需的供體序列取代靶基因序列來進行基因敲除或敲入基因組的操作。HeLa細胞是一種侵襲性宮頸癌細胞系。在HeLa細胞系中進行基因編輯可以產(chǎn)生單個或多個基因敲除，正確的突變或插入報告基因轉(zhuǎn)基因。這些經(jīng)過基因組編輯的HeLa細胞系將提供給研究人員用于研究癌癥，癌癥治療，細胞死亡，功能基因組學，信號通路，藥物研發(fā)，藥物反應和細胞治療。

單克隆擴增和凍存（提供細胞鑒定報告）細胞檢測及培養(yǎng)（提供細胞檢測報告）單克隆形成陽性克隆鑒定

（基因編輯效率提升10倍）圖：針對工程ESC和iPSC的CRISPR-U?定制流程源井生物自主研發(fā)的CRISPR-U?可用于HeLa細胞系的基因操作。因此，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在HeLa細胞中實現(xiàn)基因組編輯。源井生物可以定制真核HeLa細胞中的基因編輯，也可以在動物模型中進行各種基因改造。單克隆擴增和凍存（提供細胞鑒定報告）細胞檢測及培養(yǎng)（提供細胞檢測報告）單克隆形成陽性克隆鑒定

（基因編輯效率提升10倍）源井生物自主研發(fā)的CRISPR-U?技術(shù)優(yōu)化了真核細胞和動物基因編輯載體和過程。效率和準確度比傳統(tǒng)方法提高了10倍。馬上聯(lián)系我們，了解與您研究相關(guān)的服務吧！基因敲除Hela的研究案例：CRISPR/Cas9介導的TERT的紊亂可抑制腫瘤細胞的存活端粒是真核細胞中維持染色體完整性的一種獨特結(jié)構(gòu)。哺乳動物的端粒長度主要受端粒酶的調(diào)控，而端粒酶是一種核糖核蛋白，由逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）和RNA亞基（TERC）組成。TERC在所有細胞中都有組成性表達，而TERT的表達則是在大多數(shù)成年體細胞中受到時間和空間上的調(diào)控。在體細胞中，TERT被滅活，因此端粒酶活性不會被檢測到。而大多數(shù)腫瘤細胞通過激活TERT的機制來阻止進行性端粒侵蝕以實現(xiàn)增殖永生。因此，TERT失活被認為是一種很有前景的腫瘤治療手段，研究人員利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯系統(tǒng)來靶向癌細胞中的TERT基因。為此，他們選擇了三種不同的癌細胞系：宮頸癌細胞系（HeLa）、胰腺癌細胞系（PANC1）和乳腺癌細胞系（SUM159），并設計了三個分別針對人類TERT基因外顯子2（E2）、夕卜顯子4（E4）和夕卜顯子6（E6）的gRNAs（sg1、sg2和sg3）。研究人員進一步設計了另外兩個靶向TERT夕卜顯子4（E4）側(cè)翼內(nèi)含子的gRNAs（sg4和sg5）來產(chǎn)生KO-TERT細胞。在單倍劑量不足的研究中，突變的TERT細胞端粒酶活性降低，端粒變短。與WTPE-Hela細胞相比，細胞增值測■、細胞培養(yǎng)密度和更強的陽9那染色信號都顯示出突變的TERT細胞產(chǎn)生了嚴重的細胞衰老。AnnexinV和PI染色也提供了細胞凋亡的證據(jù)：突變的TERT細胞比WTPE-Hela細胞具有更高的凋亡率；在體外腫瘤細胞中缺乏TERT單鏈則導致細胞的生長遲緩和加速死亡。WTPfTERT*LU*喜號也1蘭母3<，附呻圖1:Tert+/-癌細胞生長遲緩，細胞加速死亡。（A）WT和TERT+/-Hela細胞的群體倍增時間。（B）第2代（P2）、P5和P7代WT和TERT+/-Hela細胞的光學顯微鏡圖像。（C）WT和TERT+/-Hela細胞的&-gal染色。箭頭指示嚴重衰老細胞的例子。（D）LDH法測定WT和TERT+/-Hela細胞的細胞死亡率。（E）流式細胞術(shù)定量分析annexin-V和碘化丙啶（PI）染色對WT和TERT+/-Hela細胞中的細胞凋亡現(xiàn)象。**p<0.01。WTPfTERT*LU*喜號也1蘭母3<，附呻研究人員進一步利用腫瘤異種移植的裸鼠模型研究7TERT單倍劑量不足對腫瘤細胞的存活率的影響，并在接種后6周檢查異種移植物的大小。正如預期，WTPE-Hela細胞在動物體內(nèi)生長成直徑約2cm的腫瘤塊而TERT突變的Hela細胞在動物體內(nèi)未能形成任何的腫瘤塊，這一結(jié)果證明了Cas9介導的TERT單倍劑量不足可以有效地抑制腫瘤細胞的生長。9V'茉好工尊用，舌風回玄茸秘必ISN'M印°(卸)VISN□i(W)H-ISN區(qū)好ISN'食螭風乃至舌工砌郢部。回Bhk*中覃詢菜Y址昌丑盅莘+ISN刖喇詢(Bl/\ll/\l)BSI2H融VNOEtflSrWSW^W(ISI/J)辿ri__*J辿ri__*Jtt王/串EK利善弄圃16部丫做基麟覃ZHSN科肇蠢Y值6SBDAidSniD:磁■蓉岬BPH阿鄲睛屋蟾*址昔風M豐閽避丑醐甌率H-/+輜丑也_LM：乙國EQgkO9仲□05L席665?!^#EQgkO9仲□05L席665?!^#auD|\|?nmimiimuauo^l.mpllklllillplllpjl況心卜」.HTWiHinniiiiiniiii_■A_如％?」駟座7*^313dlM-/4.LH313d_LM-/41H313dLAA-/41W3LIdlM岫H說11面penUS"I1U6隊職1

早前的一項研究表明，MMR基因敲除小鼠中的腫瘤并未表現(xiàn)出MSI-H腫瘤中典型的劇烈微衛(wèi)星變化（即B型），而是小而細微的改變（即A型）。林奇綜合征（LS）被稱為遺傳^浦肉性結(jié)直腸癌（HNPCC）,S?傳性結(jié)腸癌（結(jié)腸癌）的最常見原MLHL,MSH2,MSH6,PMS2和EPCAM這些基因的突變是造成林奇綜合征的因素。在這項研究中，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將林奇綜合征（LS）中的MSH2突變引入到HeLa細胞中。研究人員使用基因組編輯載體pSpCas9（BB）-2A-Puro（pX459），gRNA（由CRISPR-direct和CRISPR設計工具設計）并使用BbsI位點亞克隆到pX459中。使用Lipofectamine2000將編碼gRNA的pX459質(zhì)粒和三種不同的單鏈ssODN共同轉(zhuǎn)染到細胞中。產(chǎn)生的突變克隆清楚地表現(xiàn)出具有烷化劑耐受性和突變頻率升高的MMR缺陷表型。然而，微衛(wèi)星并沒有像MSI-H腫瘤在林奇綜合征患者中表現(xiàn)得那么顯著地不穩(wěn)定，且所有觀察到的變化均為A型，而這恰恰證實了小鼠的結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)表明人類基因組中重復不穩(wěn)定的分子機制是更加復雜的。腸癌（結(jié)腸癌）的最常見原MLHL,MSH2,MSH6,PMS2和EPCAMATP睥HMisrnaicnbindingWalkerAEcdifGPNKMGI.'KSMSH2L&wrH,s&pJertsM.muscufus071TWTATt；ZCT：AAATCkNWU.K￡JMefIIG674RAATATGCGTAAATCA8GKST&mAlG674DAikTATCGQAGACAAATCXJSuKSAji|G674AAATATGGGAGCTATP睥HMisrnaicnbindingWalkerAEcdifGPNKMGI.'KSMSH2L&wrH,s&pJertsM.muscufus071TWTATt；ZCT：AAATCkNWU.K￡JMefIIG674RAATATGCGTAAATCA8GKST&mAlG674DAikTATCGQAGACAAATCXJSuKSAji|G674AAATATGGGAGCTAAATCA.MGAKSGFM阡】3-琦□KSs&ODN(Gfi74R):§B-S8Q&N{G674D)：..AFiTATG-3GA'：5AC^ATC^..G674D(DA02)G674R(RODS)53&&N^O574AJ:9.…心mTGGmGCT心ES..章TT海G.TG674A(AG11)這項研究已成功獲取了MSH2突變的HeLa克隆，并且這些已建立的克隆明顯表現(xiàn)出具有烷化劑耐受性和升高的突變頻率的MMR缺陷表型。盡管在這些克隆■n,中，微衛(wèi)星并未像林奇綜合征患者中的腫瘤那樣表現(xiàn)出明顯不穩(wěn)定。目前的發(fā)表明，除了MMRtme外，以前無法識別出的分子機制可能是人類細胞重復失穩(wěn)的根本基因敲入Hela的研究案例：■n,sgRNA的可逆遮蓋/揭開策略（Cloaking/Uncloakingstrategy）可控制CRISPR-Cas9在體外和活細胞中的基因編輯效率RNA“遮蓋”（RNACloaking）是控制RNA雜交，折疊和酶促相互作用的溫和且可逆的一種化學方法。在這項研究中，研究人員使用疊氮化物取代的酰基咪唑試劑（NAI-N3）在合成后酰化RNA的20-OH基團，導致RNA折疊，雜交和功能的阻斷。使用水溶性磷化氫處理后，此類聚酰化（〃遮蓋”）RNA的體外活性可被有效修復，這種水溶性磷化氫引起疊氮化物的施陶丁格還原反應，然后自發(fā)地失去酰基（〃揭開”）。研究人員用sgRNAs研究這些可逆的遮蓋/揭開現(xiàn)象，來調(diào)控CRISPR-Cas9系統(tǒng)在體外和活細胞中的基因編輯效率對于體外研究，研究人員設計了一種體外基因編輯模型平臺，該平臺具有103個核苷酸長（nt）的合成sgRNA，是以Cy5標記的雙鏈DNA（dsDNA）為靶點并編碼一部分的綠色熒光蛋白（GFP）。他們發(fā)現(xiàn)，當被“遮蓋”的sgRNA與三羥丙基膦（THPP）或二苯基膦苯-3-磺酸鹽（TPPMS）在濃度為1-5mM的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）緩沖液中于37°C培養(yǎng)1小時時，得到了最高程度的Cas9介導的DNA切割——表現(xiàn)為在定量層面上活性被完全恢復到未處理sgRNA的水平。這種驚人的體外表現(xiàn)表明了該方法在CRISPR-Cas9診斷應用中的控制時機和啟動方面是有潛在用途的。對于體內(nèi)研究，研究人員使用了GFP陽性的HeLa細胞，而這些細胞最初是通過核轉(zhuǎn)染或商用陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染GFP靶向sgRNA和Cas9蛋白。他們進行了一項實驗，基于與體外實驗相同的步驟，用來測試〃遮蓋”由CART遞送的GFP靶向sgRNA是否能夠阻斷在GFP陽性HeLa細胞中CRISPR-Cas9的基因組編輯。他們觀察到用“遮蓋”的sgRNA/Cas9mRNA轉(zhuǎn)染的GFP陽性細胞與未處理的細胞有著相同的GFP熒光表達水平。這證實了sgRNA的酰化基本上阻斷了活細胞中的所有sgRNA的活性。因此，該研究強調(diào)了可逆RNA酰化可作為一種新的方法來控制基因組編輯的功能。

dsDIMACleavageproduct*TargetDNA圖1:（a）NAI-N3抑制。RISPR-Cas9基因編輯的機制。sgRNA的“遮蓋”是通過Cas9核酸酶抑制RNA引導的DNA雙鏈切割（6）使用Cy5標記的dsDNA和未處理的，“遮蓋”的和〃揭開、未遮蓋”的（磷化氫處理的）sgRNA在體外的Cas9核酸酶測定的PAGE分析。（c）條形圖表示gRNA與Cas9s培養(yǎng)后的DNAdsDIMACleavageproduct*Tar