糖尿病基因診斷31、別人笑我太瘋癲，我笑他人看不穿。(名言網)32、我不想聽失意者的哭泣，抱怨者的牢騷，這是羊群中的瘟疫，我不能被它傳染。我要盡量避免絕望，辛勤耕耘，忍受苦楚。我一試再試，爭取每天的成功，避免以失敗收常在別人停滯不前時，我繼續拼搏。33、如果懼怕前面跌宕的山巖，生命就永遠只能是死水一潭。34、當你眼淚忍不住要流出來的時候，睜大眼睛，千萬別眨眼!你會看到世界由清晰變模糊的全過程，心會在你淚水落下的那一刻變得清澈明晰。鹽。注定要融化的，也許是用眼淚的方式。35、不要以為自己成功一次就可以了，也不要以為過去的光榮可以被永遠肯定。糖尿病基因診斷糖尿病基因診斷31、別人笑我太瘋癲，我笑他人看不穿。(名言網)32、我不想聽失意者的哭泣，抱怨者的牢騷，這是羊群中的瘟疫，我不能被它傳染。我要盡量避免絕望，辛勤耕耘，忍受苦楚。我一試再試，爭取每天的成功，避免以失敗收常在別人停滯不前時，我繼續拼搏。33、如果懼怕前面跌宕的山巖，生命就永遠只能是死水一潭。34、當你眼淚忍不住要流出來的時候，睜大眼睛，千萬別眨眼!你會看到世界由清晰變模糊的全過程，心會在你淚水落下的那一刻變得清澈明晰。鹽。注定要融化的，也許是用眼淚的方式。35、不要以為自己成功一次就可以了，也不要以為過去的光榮可以被永遠肯定。的基因診斷糖尿病一.糖尿病的臨床表現二.輔助檢查三.糖尿病的基因診斷糖尿病基因診斷31、別人笑我太瘋癲，我笑他人看不穿。(名言網1糖尿病基因診斷課件2糖尿病基因診斷課件3糖尿病基因診斷課件4糖尿病基因診斷課件5二.輔助檢查血糖的測定口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）空腹血漿或血清胰島素及C肽測定胰島素或C肽釋放試驗糖基化血紅蛋白測定糖化血清蛋白測定自身抗體測定其他檢查二.輔助檢查血糖的測定61999年WHO修改糖尿病標準如下：空腹血糖(FPG)的分類：＜6．0mmol／L為正常；≥6．0～＜7．0mmol／L為空腹血糖過高(未達糖尿病，簡稱IFG)；≥7．0mmol／L為糖尿病(需另一天再次證實)。空腹血糖的定義是至少8小時沒有熱量的攝入。1999年WHO修改糖尿病標準如下：7

可疑糖尿病，空腹及餐后血糖增高但未達到糖尿病診斷標準者應行此試驗。成人采用75g葡萄糖負荷，兒童1．75g/kg，正常人血糖高峰出現于服糖后1/2～1h，峰值不超過8．9～10mmol/L(160～180mg/dl)。可疑糖尿病，空腹及餐后血糖增高但未達到糖尿病診斷標準者8采用放射免疫法測定的胰島素包括胰島素原及與抗體結合的胰島素。C肽測定不受胰島素抗體影響，不與胰島素產生交叉免疫反應，也不受外源性胰島素干擾。1型糖尿病空腹血漿胰島素和C肽水平很低，2型糖尿病則多為正常或增高。采用放射免疫法測定的胰島素包括胰島素原及與抗體結合的胰島素。9本試驗的方法與OGTT相同，只是于空腹，服糖后30，60，120，180min時采血同時測胰島素或C肽，以直接了解胰島β細胞的功能狀態。正常人血胰島素和C肽的高峰與血糖高峰一致，于服糖后30～60分鐘胰島素測值為空腹的5～10倍，C肽測值為空腹的5～6倍。1型糖尿病患者糖負荷后無胰島素和C肽釋放反應峰，其釋放曲線呈低平狀態；2型糖尿病肥胖患者，糖負荷后胰島素和C肽釋放反應峰值正常或增高，但高峰卻在2h后延遲出現；病程已久消瘦2型糖尿病患者胰島素和C肽的釋放反應峰值低于正常。本試驗的方法與OGTT相同，只是于空腹，服糖后30，60，110糖基化血紅蛋白(GHb)含量與血糖濃度呈正比，可反映2～3個月前體內血糖的平均水平。糖基化血紅蛋白的主要成分為HbAlc，因此常以HbAlc代表GHb。GHb(或HbAlc)的測值因測定方法不同而略有差異，約在3．6%～6．3%的范圍之內。未控制的糖尿病患者GHb可為正常人的2至3倍。糖基化血紅蛋白(GHb)含量與血糖濃度呈正比，可反映2～3個11自身抗體包括胰島細胞抗體(ICA)、胰島素抗體(IAA)及谷氨酸脫羥酶(GAD)抗體測定。1型糖尿病患者血清中該三種抗體可同時存在，亦可僅測到1～2種。三種抗體中GAD存在的時間較長，于發病10余年后仍可測到該抗體。自身抗體包括胰島細胞抗體(ICA)、胰島素抗體(IAA)及谷12

三.糖尿病的基因診斷三.糖尿病的基因診斷13基因突變分型一、線粒體基因突變二、胰島素基因突變三、胰島素受體基因突變四、葡糖糖激酶基因突變五、其他基因突變基因突變分型一、線粒體基因突變141、線粒體DNA點突變：

線粒體DNA(mtDNA)3243位點tRNALeu(UUR)基因A→G突變是DM的致病基因。2、線粒體DNA缺失突變:10.4kb缺失(nt4398-14882);7.5kb(nt6080-13800);7.6kb(nt6465-14135)3、線粒體DNA重復突變：Poulton等報道2例，分別為8kb（nt6000-15000）及8kb（nt7000-16000）

一、線粒體基因突變1、線粒體DNA點突變：一、線粒體基因突變15糖尿病基因診斷課件16二、胰島素基因突變

應用聚合酶鏈反應—單鏈構象多態性(PCR—SSCP)及等位基因特異性寡核苷酸斑點雜交技術對INS基因進行分析，發現有Arg65→His、Arg65→leu以及Hisl00→Asp等點突變。此3種突變均可導致血中胰島素原不能轉換為胰島素，從而引起高胰島素原血癥。二、胰島素基因突變應用聚合酶鏈反應—單鏈構象多態性(PCR17

Moller等對INSR基因的全部外顯子篩查后發現，外顯子2，3，8，9，13，17中有無義突變，外顯子20中存在一個異質性點突變。(CGG→CAG、Argl174→Gln)該突變位于酪氨酸激酶區內，影響受體細胞內亞基的結構，是引起遺傳性胰島素抵抗（insulinresistance，IR）的主要原因。三、胰島素受體基因突變Moller等對INSR基因的全部外顯子篩查后發現，外18糖尿病基因診斷課件19糖尿病基因診斷課件20四、葡萄糖激酶基因突變

對GCK的12個外顯子作單鏈構象多態性(SSCP)／測序分析進行分子篩查，發現多種GCK突變，到目前為止已知致NIDDM的GCK突變近30種，以錯義突變多見，亦有無義突變、剪接點突變及堿基缺失。四、葡萄糖激酶基因突變21糖尿病基因診斷課件22五、其他基因突變1．己糖激酶Ⅱ(hexokinaseⅡ，HK2)基因突變2．磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因突變3．糖原合成酶(glycogensynthetase，GSY)基因突變4．載脂蛋白基因群及低密度脂蛋白受體基因突變五、其他基因突變1．己糖激酶Ⅱ(hexokinaseⅡ，HK23糖尿病基因診斷課件24糖尿病相關基因診斷技術

＊等位基因特異性寡核苷酸斑點雜交技術＊測序分析進行分子篩查＊PCR

＊

PCR-SSCP

＊

PCR-DGGE

＊基因芯片

糖尿病相關基因診斷技術＊等位基因特異性寡核苷酸斑點雜交技術25線粒體基因突變糖尿病—PCR技術常規方法提取基因組DNA(包括核DNA和線粒體DNA)。PCR法擴增含3243位點的線粒體DNA片段,引物R:5’2GTTTTAGGGGCTCTTTGGT2GAAGAGTT23’;引物F:5’2TTGGATCA2GGACATCC2CGATGGTGCAG23’。組成PCR總反應體系50μl,置熱循環儀內,94℃變性30s,60℃退火45s,72℃延伸1min,共30個循環,最后再72℃延伸10min。線粒體基因突變糖尿病—PCR技術常規方法提取基因組DNA(26用限制性內切酶ApaI酶切PCR反應產物。取30μlPCR反應產物,再加3.4μlL2Buffer及1μlApaé酶(20u∕μl)混勻,37℃水浴3h,使之充分酶解。酶解產物用溴化乙錠染色,然后用1.5%瓊脂糖電泳檢測,最后在紫外燈下觀察結果。糖尿病基因診斷課件271～4:突變;5、6:無突變;C:正常PCR擴增產物為500bp。線粒體3243位點突變者的白細胞中含有野生型和突變型mtDNA,呈異質性。A→G突變,形成GGGCCC序列能被限制性內切酶ApaI識別。酶切后,在1.5%瓊脂糖電泳帶上可見500bp及重疊在一起的250bp2個片段,無此突變者僅見500bp1個片段。1～4:突變;PCR擴增產物為500bp。線粒體328單鏈構象多態性(Single-StrandConformationPolymorphism，SSCP)原理：基于序列不同的DNA單鏈片段，其空間構象亦有所不同，當其在非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時，其泳的位置亦發生變化而表現出不同序列單鏈其電泳遷頻率的差異，從而據引判斷有無突變存在.單鏈構象多態性(Single-StrandConforma29步驟：1、PCR擴增靶DNA。2、PCR產物的快速變性而后快速復性，形成特定空間結構的DNA單鏈分子。3、非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。4、PAGE膠的銀染。步驟：30糖尿病基因診斷課件31基因芯片（genechip）

指通過微陣(Microarray)技術將高密度DNA片段通過高速點樣機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如硅片、膜、玻璃片等固相表面，以同位素或熒光標記的DNA待測樣品，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監測等方面研究的技術。“探針”：載玻片或尼龍膜表面的寡核苷酸“樣品”：標記了熒光或同位素待測靶核酸——DNA、cDNA或RNA基因芯片（genechip）指通過微陣(Microa32近日從武漢大學中南醫院了解到,該院周新教授率領的課題組新近發明的糖尿病基因診斷芯片,可以通過基因檢測在一天之內確診線粒體型糖尿病。

將成千上萬個我們克隆到的特異性靶基因固定在一塊芯片上，對來源于不同個體、不同組織、不同細胞周期、不同發育階段、不同分化階段、不同病變、不同刺激（包括不同誘導、不同治療手段）下細胞內的mRNA或逆轉錄所得的cDNA進行檢測，從而對這些基因表達的個體特異性組織特異性發育階段特異性分化階段特異性。進行綜合評定與判斷，極大加快這些基因功能的確立。近日從武漢大學中南醫院了解到,該院周新教授率領的課題組新近33基因芯片工作流程基因芯片工作流程34病例唐同學，男，15歲。三個月前受涼感冒，之后常感覺口渴、總想喝水、感覺沒有力氣，體重減輕5斤。以為是感冒還沒完全好，沒有在意，口渴時就喝可樂等甜飲。兩天前明顯感覺沒力氣，并出現惡心、嘔吐、上腹不適。到醫院查空腹血糖22.7mmol/L；尿常規：葡萄糖4+，酮體3+，蛋白-。血常規：WBC13.6*109/L；肝功、腎功、血脂、尿酸、血尿淀粉酶正常；血氣分析：PH值7.05；尿微量白蛋白正常；心電圖：竇性心動過速；肝膽脾雙腎B超：脂肪肝。體檢：血壓90/60mmHg，身高169cm，體重48kg，皮膚粘膜較干燥，雙肺呼吸音稍粗，心率110次/分，律齊，心界無擴大，心音正常，各瓣膜聽診區未聞及雜音，雙下肢無水腫。診斷：1型糖尿病，糖尿病酮癥酸中毒。治療：立即給與小劑量胰島素持續靜滴，補液，及其他對癥支持治療，患者血糖逐漸降至正常，惡心嘔吐消失，精神明顯好轉，尿酮體轉陰后改為胰島素皮下注射。查胰島素釋放顯示：0’-2.1uIU/ml，30’-13.5uIU/ml，60’-17.8uIU/ml，120’-17.5uIU/ml，180’-11.8uIU/ml。繼續胰島素治療，監測血糖，調整胰島素用量。病例唐同學，男，15歲。三個月前受涼感冒，之后常感覺口渴、總35Thankyou!小組人員：王靜吳菁魏桂紅周晉星Thankyou!小組人員：王靜36謝謝！21、要知道對好事的稱頌過于夸大，也會招來人們的反感輕蔑和嫉妒。——培根

22、業精于勤，荒于嬉；行成于思，毀于隨。——韓愈

23、一切節省，歸根到底都歸結為時間的節省。——馬克思

24、意志命運往往背道而馳，決心到最后會全部推倒。——莎士比亞

25、學習是勞動，是充滿思想的勞動。——烏申斯基供婁浪頹藍辣襖駒靴鋸瀾互慌仲寫繹衰斡染圾明將呆則孰盆瘸砒腥悉漠塹脊髓灰質炎(講課2019)脊髓灰質炎(講課2019)謝謝！21、要知道對好事的稱頌過于夸大，也會招來人們的反感輕37糖尿病基因診斷31、別人笑我太瘋癲，我笑他人看不穿。(名言網)32、我不想聽失意者的哭泣，抱怨者的牢騷，這是羊群中的瘟疫，我不能被它傳染。我要盡量避免絕望，辛勤耕耘，忍受苦楚。我一試再試，爭取每天的成功，避免以失敗收常在別人停滯不前時，我繼續拼搏。33、如果懼怕前面跌宕的山巖，生命就永遠只能是死水一潭。34、當你眼淚忍不住要流出來的時候，睜大眼睛，千萬別眨眼!你會看到世界由清晰變模糊的全過程，心會在你淚水落下的那一刻變得清澈明晰。鹽。注定要融化的，也許是用眼淚的方式。35、不要以為自己成功一次就可以了，也不要以為過去的光榮可以被永遠肯定。糖尿病基因診斷糖尿病基因診斷31、別人笑我太瘋癲，我笑他人看不穿。(名言網)32、我不想聽失意者的哭泣，抱怨者的牢騷，這是羊群中的瘟疫，我不能被它傳染。我要盡量避免絕望，辛勤耕耘，忍受苦楚。我一試再試，爭取每天的成功，避免以失敗收常在別人停滯不前時，我繼續拼搏。33、如果懼怕前面跌宕的山巖，生命就永遠只能是死水一潭。34、當你眼淚忍不住要流出來的時候，睜大眼睛，千萬別眨眼!你會看到世界由清晰變模糊的全過程，心會在你淚水落下的那一刻變得清澈明晰。鹽。注定要融化的，也許是用眼淚的方式。35、不要以為自己成功一次就可以了，也不要以為過去的光榮可以被永遠肯定。的基因診斷糖尿病一.糖尿病的臨床表現二.輔助檢查三.糖尿病的基因診斷糖尿病基因診斷31、別人笑我太瘋癲，我笑他人看不穿。(名言網38糖尿病基因診斷課件39糖尿病基因診斷課件40糖尿病基因診斷課件41糖尿病基因診斷課件42二.輔助檢查血糖的測定口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）空腹血漿或血清胰島素及C肽測定胰島素或C肽釋放試驗糖基化血紅蛋白測定糖化血清蛋白測定自身抗體測定其他檢查二.輔助檢查血糖的測定431999年WHO修改糖尿病標準如下：空腹血糖(FPG)的分類：＜6．0mmol／L為正常；≥6．0～＜7．0mmol／L為空腹血糖過高(未達糖尿病，簡稱IFG)；≥7．0mmol／L為糖尿病(需另一天再次證實)。空腹血糖的定義是至少8小時沒有熱量的攝入。1999年WHO修改糖尿病標準如下：44

可疑糖尿病，空腹及餐后血糖增高但未達到糖尿病診斷標準者應行此試驗。成人采用75g葡萄糖負荷，兒童1．75g/kg，正常人血糖高峰出現于服糖后1/2～1h，峰值不超過8．9～10mmol/L(160～180mg/dl)。可疑糖尿病，空腹及餐后血糖增高但未達到糖尿病診斷標準者45采用放射免疫法測定的胰島素包括胰島素原及與抗體結合的胰島素。C肽測定不受胰島素抗體影響，不與胰島素產生交叉免疫反應，也不受外源性胰島素干擾。1型糖尿病空腹血漿胰島素和C肽水平很低，2型糖尿病則多為正常或增高。采用放射免疫法測定的胰島素包括胰島素原及與抗體結合的胰島素。46本試驗的方法與OGTT相同，只是于空腹，服糖后30，60，120，180min時采血同時測胰島素或C肽，以直接了解胰島β細胞的功能狀態。正常人血胰島素和C肽的高峰與血糖高峰一致，于服糖后30～60分鐘胰島素測值為空腹的5～10倍，C肽測值為空腹的5～6倍。1型糖尿病患者糖負荷后無胰島素和C肽釋放反應峰，其釋放曲線呈低平狀態；2型糖尿病肥胖患者，糖負荷后胰島素和C肽釋放反應峰值正常或增高，但高峰卻在2h后延遲出現；病程已久消瘦2型糖尿病患者胰島素和C肽的釋放反應峰值低于正常。本試驗的方法與OGTT相同，只是于空腹，服糖后30，60，147糖基化血紅蛋白(GHb)含量與血糖濃度呈正比，可反映2～3個月前體內血糖的平均水平。糖基化血紅蛋白的主要成分為HbAlc，因此常以HbAlc代表GHb。GHb(或HbAlc)的測值因測定方法不同而略有差異，約在3．6%～6．3%的范圍之內。未控制的糖尿病患者GHb可為正常人的2至3倍。糖基化血紅蛋白(GHb)含量與血糖濃度呈正比，可反映2～3個48自身抗體包括胰島細胞抗體(ICA)、胰島素抗體(IAA)及谷氨酸脫羥酶(GAD)抗體測定。1型糖尿病患者血清中該三種抗體可同時存在，亦可僅測到1～2種。三種抗體中GAD存在的時間較長，于發病10余年后仍可測到該抗體。自身抗體包括胰島細胞抗體(ICA)、胰島素抗體(IAA)及谷49

三.糖尿病的基因診斷三.糖尿病的基因診斷50基因突變分型一、線粒體基因突變二、胰島素基因突變三、胰島素受體基因突變四、葡糖糖激酶基因突變五、其他基因突變基因突變分型一、線粒體基因突變511、線粒體DNA點突變：

線粒體DNA(mtDNA)3243位點tRNALeu(UUR)基因A→G突變是DM的致病基因。2、線粒體DNA缺失突變:10.4kb缺失(nt4398-14882);7.5kb(nt6080-13800);7.6kb(nt6465-14135)3、線粒體DNA重復突變：Poulton等報道2例，分別為8kb（nt6000-15000）及8kb（nt7000-16000）

一、線粒體基因突變1、線粒體DNA點突變：一、線粒體基因突變52糖尿病基因診斷課件53二、胰島素基因突變

應用聚合酶鏈反應—單鏈構象多態性(PCR—SSCP)及等位基因特異性寡核苷酸斑點雜交技術對INS基因進行分析，發現有Arg65→His、Arg65→leu以及Hisl00→Asp等點突變。此3種突變均可導致血中胰島素原不能轉換為胰島素，從而引起高胰島素原血癥。二、胰島素基因突變應用聚合酶鏈反應—單鏈構象多態性(PCR54

Moller等對INSR基因的全部外顯子篩查后發現，外顯子2，3，8，9，13，17中有無義突變，外顯子20中存在一個異質性點突變。(CGG→CAG、Argl174→Gln)該突變位于酪氨酸激酶區內，影響受體細胞內亞基的結構，是引起遺傳性胰島素抵抗（insulinresistance，IR）的主要原因。三、胰島素受體基因突變Moller等對INSR基因的全部外顯子篩查后發現，外55糖尿病基因診斷課件56糖尿病基因診斷課件57四、葡萄糖激酶基因突變

對GCK的12個外顯子作單鏈構象多態性(SSCP)／測序分析進行分子篩查，發現多種GCK突變，到目前為止已知致NIDDM的GCK突變近30種，以錯義突變多見，亦有無義突變、剪接點突變及堿基缺失。四、葡萄糖激酶基因突變58糖尿病基因診斷課件59五、其他基因突變1．己糖激酶Ⅱ(hexokinaseⅡ，HK2)基因突變2．磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因突變3．糖原合成酶(glycogensynthetase，GSY)基因突變4．載脂蛋白基因群及低密度脂蛋白受體基因突變五、其他基因突變1．己糖激酶Ⅱ(hexokinaseⅡ，HK60糖尿病基因診斷課件61糖尿病相關基因診斷技術

＊等位基因特異性寡核苷酸斑點雜交技術＊測序分析進行分子篩查＊PCR

＊

PCR-SSCP

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PCR-DGGE

＊基因芯片

糖尿病相關基因診斷技術＊等位基因特異性寡核苷酸斑點雜交技術62線粒體基因突變糖尿病—PCR技術常規方法提取基因組DNA(包括核DNA和線粒體DNA)。PCR法擴增含3243位點的線粒體DNA片段,引物R:5’2GTTTTAGGGGCTCTTTGGT2GAAGAGTT23’;引物F:5’2TTGGATCA2GGACATCC2CGATGGTGCAG23’。組成PCR總反應體系50μl,置熱循環儀內,94℃變性30s,60℃退火45s,72℃延伸1min,共30個循環,最后再72℃延伸10min。線粒體基因突變糖尿病—PCR技術常規方法提取基因組DNA(63用限制性內切酶ApaI酶切PCR反應產物。取30μlPCR反應產物,再加3.4μlL2Buffer及1μlApaé酶(20u∕μl)混勻,37℃水浴3h,使之充分酶解。酶解產物用溴化乙錠染色,然后用1.5%瓊脂糖電泳檢測,最后在紫外燈下觀察結果。糖尿病基因診斷課件641～4:突變;5、6:無突變;C:正常PCR擴增產物為500bp。線粒體3243位點突變者的白細胞中含有野生型和突變型mtDNA,呈異質性。A→G突變,形成GGGCCC序列能被限制性內切酶ApaI識別。酶切后,在1.5%瓊脂糖電泳帶上可見500bp及重疊在一起的250bp2個片段,無此突變者僅見500bp1個片段。1～4:突變;PCR擴增產物為500bp。線粒體365單鏈構象多態性(Single-StrandConformationPolymorphism，SSCP)原理：基于序列不同的DNA單鏈片段，其空間構象亦有所不同，當其在非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳時，其泳的位置亦發生變化而表現出不同序列單鏈其電泳遷頻率的差異，從而據引判斷有無突變存在.單鏈構象多態性(Single-StrandConforma66步驟：1、PCR擴增靶DNA。2、PCR產物的快速變性而后快速復性，形成特定空間結構的DNA單鏈分子。3、非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。4、PAGE膠的銀染。步驟：67糖尿病基因診斷課件68基因芯片（genechip）

指通過微陣(Microarray)技術將高密度DNA片段通過高速點樣機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如硅片、膜、玻璃片等固相表面，以同位素或熒光標記的DNA待測樣品，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監測等方面研究的技術。“探針”：載玻片或尼龍膜表面的寡核苷酸“樣品”：標記了熒光或同位素待測靶核酸——DNA、cDNA或RNA基因芯片（genechip）指通過微陣(Microa69近日從武漢大學中南醫院了解到,該院周新教授率領的課題組新近發明的糖尿病基因診斷芯片