電話：400-998-2324郵箱：service_uplc_ms@163.com網址：本產品僅供科學研究使用！請勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測等用途！-上海液質檢測技術有限公司第第頁輔酶IINADP(H)含量檢測試劑盒（MTT顯色法）說明書貨號：UPLC-MS-4370規格：50T/24S

可見分光光度法產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系工作人員。試劑名稱規格保存條件酸性提取液液體15mL×1瓶2-8℃保存堿性提取液液體15mL×1瓶2-8℃保存試劑一液體20mL×1瓶2-8℃保存試劑二粉劑×1支-20℃保存試劑三液體12mL×1瓶2-8℃保存試劑四A粉劑×1支-20℃保存試劑四B液體5mL×1瓶2-8℃保存試劑五液體40mL×1瓶2-8℃保存試劑六液體70mL×1瓶2-8℃保存NADP標準品粉劑×1支-20℃保存NADPH標準品粉劑×1支-20℃保存溶液的配制：1、試劑二：臨用前加入6mL蒸餾水充分混勻，溶解后2-8℃保存4周。2、試劑四：臨用前將試劑四A溶解到試劑四B中，溶解后分裝保存，避免反復凍融，-20℃保存4周。3、NADP標準品：臨用前加入1.27mL蒸餾水，即5μmol/mL，-20℃可以保存2周。4NADPH標準品：臨用前加入1.2mL蒸餾水，即5μmol/mL，-202周。產品說明：輔酶ⅡNADP(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，NADP+和NADPH含量測定可以計算NADP（NADPHNADP+)NADPH/NADP+比值，其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應密切相關。NADPH/NADP+PPP途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調控作用。分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NADP+和NADPH。NADPH通過PMS的遞氫作用，使氧化型噻唑藍（MTT）還原為甲瓚，570nmNADPH6-NADP+為NADPHNADP+含量。Glucose6-Phosphate+NADP+

G6PGH

6PGL+NADPH+H+H++PMS+MTT Formazan(570nm)注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。需自備的儀器和用品：可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、研缽/勻漿器、超聲破碎儀、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸餾水。操作步驟：一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）1、血清（漿）中NADP+和NADPH的提取：NADP+0.1mL血清（漿），0.5mL5min(蓋緊，以防止水分散失)，冰浴冷卻后，10000g4℃200μL10000g4℃10min冰上保存待測。NADPH0.1mL血清（漿），0.5mL5min(蓋緊，以防止水分散失)，冰浴冷卻后，10000g4℃10min200μL，加入等體積酸性提取液；混勻，10000g4℃10min冰上保存待測。2、組織中NADP+和NADPH的提?。篘ADP+0.1g0.5mL5min(蓋緊，以防止水分散失)，4℃4℃冰上保存待測。NADPH0.1g0.5mL5min(蓋緊，以防止水分散失)，4℃4℃冰上保存待測。3、細胞或細菌中NADP+和NADPH的提取：NADP+5000.5mL1min（20200W，超2s1s）5min(蓋緊，以防止水分散失)，冰浴中冷卻后，10000g4℃10min200uL另一新的離心管中，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻，10000g4℃10min，取上清,冰上保存待測。NADPH5000.5mL1min（20200W，2s1s），5min(蓋緊，以防止水分散失)，冰浴中冷卻后，10000g4℃10min200uL至另一新的離心管中，加入等體積的酸性提取液使之中和，混勻，10000g4℃離心10min，取上清,冰上保存待測。二、測定步驟1、分光光度計預熱30min以上，調節波長至570nm，蒸餾水調零。2NADP+1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.01、0nmol/mL的標準溶液（0nmol/mL即空白管）。3NADPH250.31250.156250.0780nmol/mL（0nmol/mL即空白管）。4、稀釋表（附于說明書最后）5、在EP管中按順序加入下列試劑：試劑名稱（μL）對照管（A1）測定管（A2）標準管樣品5050-標準品--50試劑五500--試劑一250250250試劑二757575試劑三150150150試劑四353535--充分混勻，室溫避光靜置20min試劑五-500500充分混勻，靜置5min后，20000g25℃離心5min，棄上清，在沉淀中加入試劑六100010001000混勻，570nm下比色，讀取吸光值，NADP+的記為：ΔANADP+=A2-A1，NADPH的記為ΔANADPH=A2’-A1’，NADP標準管的記為ΔANADP標=A標-A空白管。NADPH標準管的記為ΔANADPH標=A標’-A空白管。（標準曲線只需做1-2次）三、NADP+和NADPH含量計算1、標準曲線繪制：NADP+（x1，nmol/mL）和吸光度ΔA標準（y1，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA代入方程得到x1（nmol/mL）。NADPH標準曲線的繪制：根據標準管的濃度（x2，nmol/mL）和吸光度ΔA標準（y2，ΔA標準），建立標準曲線。根據標準曲線，將ΔA代入方程得到x2（nmol/mL）。2、NADP+和NADPH含量計算（一）NADP+含量計算按液體體積計算：NADP+含量(nmol/mL）x1×（V提取+V血清）÷V血清=11×x1NADP+(nmol/mgprot）x1×V提取÷(V提取×Cpr)=x1CprNADP+含量(nmol/g鮮重）=x1×V提取÷W=x1÷W按細胞數量計算：NADP+含量(nmol/104cell）=x1×V提取÷500=0.002×x1（二）NADPH含量計算按液體體積計算：NADPH含量(nmol/mL）=x2×（V提取+V血清）÷V血清=11×x2NADPH(nmol/mgprot）=x2×V提取÷(V提取×Cpr)=x2÷CprNADPH含量(nmol/g鮮重）=x2×V提取÷W=x2÷W按細胞數量計算：NADPH含量(nmol/104cell）=x2×V提取÷500=0.002×x2V提?。杭尤胩崛∫后w積，1mL；V血清：血清（漿）體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數，500萬。注意事項：1、如果一次性測定樣本數較多，可將試劑一、二、三按比例配成混合液。2、反應過程中注意避光。3、由于每一個測定管需要設一個對照管，本試劑盒50管可以測定24個NADP+或NADPH。4、如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。標準溶液稀釋表NADP+標準品稀釋表 NADPH標準品稀釋表序號稀釋前濃度（序號稀釋前濃度（nmol/mL）標準液體積（μL）蒸餾水體積（μL）稀釋后濃度（nmol/mL）1500010990502501009005352006001.2541.252002000.62550.6252002000.312560.31252002000.1562570.156252002000.07880.0782002000.03990.0392002000.0195100.01952002000.0111002000