免疫學中與抗原偶聯的載體蛋白的選擇原則 檢測方法_第1頁
免疫學中與抗原偶聯的載體蛋白的選擇原則 檢測方法_第2頁
免疫學中與抗原偶聯的載體蛋白的選擇原則 檢測方法_第3頁
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結的綜述,你可以參考以下:人工抗原合成常用的載體載體表面應首先應具有化學活性基團,這些基團可以直接與抗生素或農藥分子偶聯,這是化學偶聯制備抗原的前提;常用來作為合**工抗原的載體蛋白質有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、鑰孔血藍蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚賴氨酸(PLL)αε-氨基(8和1、苯酚基、巰基(等電點為9、咪唑基(等電點為7、羧基(等電點~4,大部分來β-γ-羧基)等在等電點pH條件下,一部分成為質子,另一部分未,且在不同pH和離子強度下能保持較大的溶解度。此外,這些蛋白質在用有機溶劑(如吡啶、二甲基甲酰胺)溶解時,其活性基團仍呈可溶狀態,因此,這兩種蛋白質是最常用的載體蛋白質[30]。近年來,有研究報道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚賴氨酸)作載體,表現出能增加半抗原的免疫原性,從而使產生征對半抗原的特異性抗體可能性增加,被廣泛應用[31,32]。 人工抗原合成方法小分子半抗原與載體蛋白偶聯效果會受到偶聯物的濃度及其相對比例、偶聯劑的有效濃度及其相對量、緩沖液成分及其純度和離子強度、pH以及半抗原的穩定性可溶性和理化特性等因素的影響通常是在條件溫和的水溶液中將半抗原與載體蛋白共價結合,不宜在高溫、低溫、強堿、強酸條件下進行。一般是由半抗原上的活性基團決定偶聯合成的方法常用的方法如下分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶1)混合酸酐法mixedanhydridemethod:也稱氯甲酸異丁酯法。半抗原上的羧基在正丁胺存在下與氯甲酸異丁酯反應形成混合酸酐的中間體再與蛋白質的氨基反應形成半抗原與蛋白質的結合物2)碳二亞胺法(CD:碳二亞胺(EDC)使羥基和氨基間脫水形成酰胺鍵,半抗原上的羧基先與EDC反應生成一個中間物,然后再與蛋白質上的氨基反應,形成半抗原與蛋白質的結合物(見圖1.5。EDC被稱作零長度交聯劑之一,因為它作為酰胺鍵的形成介質并沒有形成手臂分子此連接方法十分簡便只需將載體蛋白質和抗原按一定比例混合在適當的溶液中,然后加入水溶性碳化二亞胺,攪拌1~2h,置室溫24h,再經透析即可。如果半抗原分子中不含羧基,可通過某些化學反應引入羧基。在引入羧基后,也可用上述方法進行偶聯。 含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯)戊二醛法:雙功能試劑戊二醛的兩個醛基分別與半抗原和蛋白質上的氨基形成schiff鍵在半抗原和蛋白質間引入一個5碳橋。這一反應條件溫和,可在及pH6.0~8.0內進行,操作亦簡便,因此應用廣泛。戊二醛受到光照、溫度和堿性的影響,可能發生自我聚合,減弱其交聯作用,因此最好使用新鮮的戊二醛。)重氮化法:用于活性基團是芳香胺基的半抗原芳香胺基與NaNO2和HCl反應得到一個重氮鹽它可直接接到蛋白質酪氨酸羧基的鄰位上,形成一個偶氮化合物(見圖1.6。含羥基半抗原的偶聯1)琥珀酸酐法半抗原的羥基與琥珀酸酐在無水吡啶中反應得到一個琥珀酸半酯(帶有羧基的中間體再經碳二亞胺法或混合酸酐法與蛋白質氨基結合,在半抗原與蛋白質載體間插入一個琥珀酰基(圖1.7。2)羰基二咪唑法:,’-羰基二咪唑是引入羰基的高活性試劑,在肽合成中首次表明了是形成極好的酰胺鍵試劑[33]N-N-N-端(α-氨基)和賴氨酸側鏈的(-氨基)影響人工抗原質量的因素人工抗原免疫原性的好壞,與多種因素有關。對不同偶聯比偶聯比BSA5~20為宜。而榮康泰等用不同的載體制備對氧磷的人工抗原時,卻發現各種載體的分子量不論是否接近, 偶聯有研究者認為一定長度的手臂的介入有助于半抗原暴露在外面利于所產生抗體專一性的增強,如吳頌如等34〕發現,通常愈遠離載體蛋白的基團,其特征反應愈明顯但也有一些研究者發現手臂結構對免疫檢測經常有不利的影響有時產生的抗體對手臂結構親和力特別強,對待測小分子親和力卻很弱,因此造成對特異性抗體檢測的干擾。Sionf等〔35〕認為可以采取兩種方法來避免因偶聯橋而造成的不足:一是半抗原上相同位點結合蛋白質但免疫原和包被抗原用不同的偶聯橋二是免疫原和包被抗原用相同的偶聯橋,但與不同半抗原位點結合。Frieia〔36〕研究農藥酶免疫分析多年,他認為最好的偶聯橋是3~6個直鏈的碳原子結構。)半抗原的分子空間結構用來作半抗原的分子最好有分支結構直鏈分子難以產生抗體此外有些抗生素或農藥有多個可供蛋白質偶聯的位點但據研究報道,不同位點與蛋白質結合制備的人工抗原產生的抗體效價及親合力都有差別,這可能是因為不同位點結合導致半抗原呈現的空間結構不一樣的原因如合成滅草松和吡蟲啉人工抗原時,當利用半抗原不同位點與載體結合時產生的抗體效價和親合力明顯不一樣[37、38]。因此,如果一個分子內有多個不同的結合位點時,最好盡可能利用不同位點都合成出人工抗原,然后,通過比較,篩選出最好的人工抗原用于制備抗體作為檢測。人工抗原的質量評定 濃度測定人工抗原的絕對含量常以蛋白質的相對濃度表示(如每ml抗原溶液中含有蛋白質多少mg。因此測定人工抗原的濃度與測定人工抗原溶液中蛋白質的相對含量(mg/ml)是一致的(這里也反映出人工抗原越純,檢出的濃度值愈準確光法等。這里就不一一介紹了。純度鑒定和結構分析鑒定農藥人工抗原最常用的方法是紫外光譜掃描法團又在哪里。這些問題可以通過紅外吸收光譜圖或質譜分析得到解決。利用吸附與分配層析和電泳技術可鑒定人工抗原的偶聯的純度。前者適應范圍廣,但鑒偶聯比的測定1)分光光度法根據趙肅清等人的說法〔39220nm(220nm以下會產生肽的強紫外吸收,如果半抗原的紫外最大吸收少于220nm,則與蛋白

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