中藥指紋圖譜研究概況湖北中醫學院藥學院干國平博士2009.11引言

中藥指紋圖譜技術是當今國際公認的控制中藥質量的質控模式，其研究的方法和技術日趨成熟完善，是目前控制中藥和天然藥質量最有效的方法和手段之一。

中藥指紋圖譜能從原藥材的栽培、引種，中成藥生產工藝的規范與優化，到產品質量標準的制定提供全方位的質量保證。引言日本漢方藥在20世紀80年代就采用高效液相指紋圖譜控制質量。歐共體也將指紋圖譜監控技術應用于植物藥質量控制。美國食品藥品管理局允許草藥保健品申報資料時提供色譜指紋圖。世界衛生組織在1996年草藥評價指導原則中也規定：如果草藥的活性成分不明，可以提供色譜指紋圖以證明產品質量的一致性。

1.我國研究中藥指紋圖譜的歷史

20世紀70年代：我國的學者嘗試用UV、IR、TLC、GC進行中藥的鑒別研究；

1.我國研究中藥指紋圖譜的歷史

20世紀80年代~90年代：《中國藥典》1995年版一部收載了TLC法鑒別中藥材及中成藥。《中國藥典》2000年版一部中藥薄層色譜鑒別引進了“對照藥材”，以完整的色譜圖像作為鑒別的依據而正式納入國家藥品標準。《中國藥典》2005年版一部HPLC、GC廣泛用于中藥的定性、定量分析

1.我國研究中藥指紋圖譜的歷史痔瘡栓中黃柏的TLC鑒別1.陰性對照2.樣品3.黃柏對照藥材

逍遙丸中甘草的鑒別（1.陰性對照、2.樣品3.對照藥材）

123甘草的來源：甘草GlycyrrhizauralensisFisch.脹果甘草GlycyrrhizainflataBat.光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根及根莖1.中藥指紋圖譜的歷史2000年:

國家藥監局頒布了《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》。國家從行政管理的角度，正式要求已注冊的中藥注射劑須進行指紋圖譜研究和納入質量標準；規范了中藥指紋圖譜的研究，從而促進了國內近幾年來對指紋圖譜的研究熱潮。2.中藥指紋圖譜的定義定義：

運用現代分析技術對中藥化學信息以圖形（圖像）的方式進行表征并加以描述。現代分析技術：TLC、TLCS、HPLC、HPLC-MS、GC、GC-MS、HPCE、IR、NMR、X-射線衍射、DNA指紋圖譜等。主要是色譜技術。2.中藥指紋圖譜的定義表征和描述：“表征”是將中藥化學信息通過色譜圖（液相色譜圖、氣相色譜圖或薄層色譜圖）等方式進行表達；“描述”是對指紋圖譜經過計算、分析、比較、評價等過程，以技術參數、指紋特征等加以說明。分析比較的結果，是對供試品與對照品之間的差異或一致性作出評價。3.建立立中藥指指紋圖譜譜的目的的和意義義中藥的特特點：（1）中中藥化學學成分的的多樣性性與復雜雜性；（2）中中藥藥效效成分的的非單一一性；（3）中中藥質量量的不穩穩定性。。3.建立立中藥指指紋圖譜譜的目的的和意義義（1）對對中藥質量量控制的補補充和提高高：現有質量控控制模式：：以1個或或1個以上上成分為控控制指標，，難以準確確、全面地地評價中藥藥質量。指紋圖譜從從整體上評評價中藥的的內在質量量，已為國國際社會所所認可，有有利于中藥藥及產品進進入國際市市場。3.中藥指指紋圖譜的的研究目的的意義（2）提高高中藥質量量的穩定性性控制原料、、中間體、、成品的一一致性，減減少批間差差異，提高高中藥質量量的穩定性性。（1）系統統性：盡可能多的的覆蓋全貌貌。指紋圖譜反反映的化學學成分應包包括中藥有有效所部位位所含大部部分成份的的種類，或或指標成分分的全部。。4.中中藥指紋圖圖譜建立的的原則（2）特征征性：特征明顯，，專屬性強強。指紋圖譜中中反映的化化學成分信信息應具有有高度的選選擇性，這這些信息的的綜合結果果，將能特特征地區分分中藥的真真偽與優劣劣，成為中中藥自身的的化學條碼碼。4.中中藥指紋圖圖譜建立的的原則（3）重現現性：重現性好。。重現性是保保證指紋圖圖譜的使用用具有通用用性和實用用性的前提提。4.中中藥指紋圖圖譜建立的的原則菝葜抗腫瘤瘤活性部位位指紋圖譜譜的研究1.藥材來來源2.色譜條條件3.供試品品和對照品品溶液的制制備4.方法學學考察5.指紋圖圖譜及技術術參數1.藥材來源（10種菝菝葜、4種種近緣品種種）樣品編號藥材產地來源1湖北通城GAP基地菝葜SimliachinaL.2湖南靖州菝葜S.chinaL.3安徽墳天山菝葜S.chinaL.4廣西賓陽菝葜S.chinaL.5廣東省從化縣菝葜S.chinaL.6重慶市馬腳山菝葜S.chinaL.7浙江溫州市永嘉縣上塘鎮菝葜S.chinaL.8福建仙游菝葜S.chinaL.9湖南岳陽菝葜S.chinaL.10江西樟樹市讓山菝葜S.chinaL.

11江西弋陽小果菝葜（S.davidianaA.DC）12湖南長沙長托菝葜（S.feroxWall.exKunth）13湖北麻城黑果菝葜(S.glauco-chinaWarb.)14湖北咸寧土茯苓(S.glabraRoxb.)2.色譜條條件：KromasilC18柱柱（4.6×250mm，5μm）流速:0.8ml··min-1進樣量:20μL；；檢測波長:330mm；流動相:乙乙腈-甲甲醇-0.04％磷磷酸溶液梯度洗脫程程序（V/V,%））時間（min）乙腈甲醇0.04％磷酸溶液010387301238532173806018379100283693.供試品品溶液的制制備樣品粉末70％乙醇醇超聲提取濾過，取續續濾液蒸干殘渣熱水溶解乙酸乙酯萃萃取乙酸乙酯液液甲醇定容微孔濾膜濾濾過蒸干殘渣供試品溶液液4.對照品品溶液的制制備精密稱取黃黃杞苷對照照品適量，，加甲醇制制成每ml含50μg的溶液。。5.1精密度試驗驗5.2穩定定性試驗5.3重現現性試驗5.方法學考察察精密度和穩穩定性試驗驗結果（相對保留時時間）(n=5)峰號⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD(％)10.2750.2760.2730.2730.2750.2740.4920.3940.3960.3960.3930.3960.3950.3630.4880.490.4910.4860.490.4890.4140.8010.8040.8030.80.8020.8020.2050.8520.8550.8550.8520.8530.8530.1860.9200.920.9180.9190.9210.9200.127（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0081.2691.2651.2551.2681.2711.2660.5091.3421.3531.3551.3531.3481.3500.39101.7111.7081.6961.7071.7011.7050.35111.7771.7831.7861.7821.7781.7810.21121.8251.8311.8351.8291.8251.8290.23精密度和穩穩定性試驗驗結果（相對峰面積積）(n=5)峰號⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD（％）10.7500.7570.7750.7730.7840.7681.8120.1770.1760.1690.1750.1760.1751.8430.3590.3590.3620.3590.3600.3600.3640.2310.2330.2200.2250.2340.2292.6050.2280.2210.2210.2240.2260.2241.3861.4531.4611.4321.4621.4881.4591.387（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0087.8627.8567.8407.8417.8407.8480.1390.2540.2570.2540.2550.2530.2550.60101.2701.2741.2721.2741.2741.2730.14110.2980.2910.2900.2940.2960.2941.14120.5780.5780.5740.5780.5770.5770.30精密度與穩穩定性試驗驗結果：☆各共有有峰相對保保留時間和和相對峰面面積的RSD均小于于3％;☆儀器的的精密度良良好；☆供試品品溶液在12h內基基本穩定；；重現性試驗驗結果（相對保留時時間）(n=5)峰號⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD(％)10.2750.2760.2750.2730.2780.2750.6620.3940.3960.3960.3960.3940.3950.2830.4880.490.490.4910.4890.4900.2340.8010.8030.8020.8030.8030.8020.1150.8520.8550.8550.8530.8520.8530.1860.920.9190.920.9210.920.9200.087（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0081.2691.2641.2651.2651.2651.2660.1591.3421.3531.3551.3531.3481.3500.39101.7111.7061.7061.7061.7061.7070.13111.7771.7821.7781.7811.7821.7800.13121.8251.831.831.8311.8311.8290.14重現性試驗驗結果（相對峰面積積）(n=5)峰號⑴⑵⑶⑷⑸平均值RSD(％)10.750.7590.760.7630.7740.7611.1420.1770.1750.1790.1770.1770.1770.8030.3590.360.3590.3620.3590.3600.3640.2310.2230.220.2240.2240.2241.8050.2280.2240.2210.2270.220.2241.5861.4531.4611.4571.4591.4621.4580.257(S)1.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0087.8627.8557.867.8497.8457.8540.0990.2540.2540.2560.2550.2530.2540.45101.271.2741.2721.2741.2731.2730.13110.2980.2930.290.2890.2970.2931.38120.5780.5750.5790.5780.5780.5780.26重現性試驗驗結果：☆各共有峰相相對保留時時間的RSD均小于于3％；☆各共有有峰相對峰峰面積的RSD均小小于3％；；☆表明方方法的重現現性好。6.指紋圖譜及及技術參數數6.1指指紋紋圖圖譜譜的的制制備備6.2共共有有指指紋紋峰峰的的標標定定6.3共共有有指指紋紋峰峰面面積積的的比比值值6.4非非共共有有峰峰面面積積的的比比值值6.5主主要要指指紋紋峰峰的的歸歸屬屬6.6相相似似度度分分析析6.1指指紋紋圖圖譜譜的的制制備備分別別精精密密吸吸取取供供試試品品溶溶液液（（10批批菝菝葜葜正正品品及及4批批菝菝葜葜近近源源品品種種）各各20μμL，，注注入入液液相相色色譜譜儀儀，，按按上上述述色色譜譜條條件件測測定定，，記記錄錄90min內色色譜譜圖圖10批批菝菝葜葜指指紋紋圖圖譜譜疊疊加加圖圖6.2共有有指指紋紋峰峰的的標標定定以相相對對保保留留時時間間標標定定了了12個個共共有有峰峰S6.2共有有指指紋紋峰峰的的標標定定(共有有峰峰相相對對保保留留時時間間)峰號樣品1234567(S)8910111210.2750.3940.4880.8010.8520.9201.0001.2691.3421.7111.7771.82520.2760.3980.4880.8000.8380.9191.0001.2721.3461.7081.7731.82030.2760.3950.4890.8040.8540.9241.0001.2761.3431.7101.7691.81640.2770.3940.490.8020.8520.9241.0001.2791.3451.7101.8061.82450.2750.3950.4890.8040.8530.9211.0001.2711.3381.6991.7671.81560.2760.3920.4710.7740.8560.9181.0001.2701.3411.6941.7681.79170.2740.3950.4850.8000.8520.9181.0001.2651.3321.6941.7681.79180.2770.3960.4890.7990.8500.9191.0001.2721.3401.7021.7691.81690.2730.3940.4850.8000.8490.9191.0001.2711.3421.7101.7741.805100.2760.3970.4900.8010.8380.9191.0001.2701.3381.7041.7681.817平均值0.2760.3950.4860.7990.8490.9201.0001.2721.3411.7041.7741.812RSD(％)0.460.021.331.051.380.99011.081.091.371.27符合合指指紋紋圖圖譜譜的的要要求求6.3共有有指指紋紋峰峰面面積積的的比比值值（以參參照照峰峰S的的峰峰面面積積為為1計計算算）峰號樣品1234567(S)8910111210.7500.1770.3590.2310.2281.4531.0007.8620.2541.2700.2980.57821.1791.4270.5271.3921.0901.8091.0007.9341.0211.6681.0090.51430.7820.1310.1650.3000.0851.0891.0006.2900.2050.4820.1430.18541.1600.2431.0750.6301.8051.8011.0007.9110.2870.7890.9820.25250.1980.8150.2030.3800.7211.0441.0006.2950.2960.6030.3380.07061.3931.6601.2961.8320.5861.8121.0006.3170.2372.7041.0880.62371.2842.4331.7551.3242.0151.4771.0006.2990.9442.6810.7970.96781.0100.3361.8690.6611.6271.4571.0006.8670.5881.0330.5610.32290.8050.2761.6510.9340.4271.7911.0009.3810.5291.7770.2280.462102.5041.3192.6251.1501.9831.2161.0009.2850.8992.3311.0250.323峰面面積積占占總總峰峰面面積積大大于于20％％，，其其差差值值不不大大于于±±20％％峰面面積積占占總總峰峰面面積積大大于于10％％，，而而小小于于20％％，，其其差差值值不不大大于于±±25％％符合合指指紋紋圖圖譜譜的的要要求求6.4非共共有有峰峰峰峰面面積積的的比比值值樣品編號非共有峰面積總峰面積比例（％）17722.52657452.91220932.811140381.8831099.9530092.0741575.31148171.3751458.8443423.2961338.21031741.2973580.51271932.8182254.71310091.7291309.6779991.68101171.1423102.77非共共有有峰峰占占總總峰峰面面積積的的比比值值均小小于于5％％符合合指指紋紋圖圖譜譜的的技技術術要要求求6.5共有有峰峰的的歸歸屬屬水飛薊賓13.0min氧化白藜蘆醇醇43.6min黃杞苷47.5min白藜蘆醇60.0min6.6指紋圖譜的相相似度樣品編號藥材產地來源相似度（％）1湖北通城GAP基地菝葜SimliachinaL.1002湖南靖州菝葜S.chinaL.99.53安徽墳天山菝葜S.chinaL.90.74廣西賓陽菝葜S.chinaL.91.35廣東省從化縣菝葜S.chinaL.89.06重慶市馬腳山菝葜S.chinaL.91.97溫州永嘉縣上塘鎮菝葜S.chinaL.94.08福建仙游菝葜S.chinaL.94.79湖南岳陽菝葜S.chinaL.91.810江西樟樹市讓山菝葜S.chinaL.

87.46.6指紋圖譜的相相似度樣品編號藥材產地來源相似度(％))1湖北通城GAP基地菝葜SimliachinaL.10011江西弋陽小果菝葜（S.davidianaA.DC）71.512湖南長沙長托菝葜（S.feroxWall.exKunth）67.913湖北麻城黑果菝葜(S.glauco-chinaWarb.)70.014湖北咸寧土茯苓(S.glabraRoxb.)65.14種近緣品種種指紋圖譜的的相似度均在在75%以下下菝葜與四種近近緣品種的指指紋圖譜比較較菝葜小果菝葜長托菝葜黑果菝葜土茯苓1.不同產地菝葜葜的指紋圖譜譜間有一定的的差異，反映映了菝葜藥材材質量的不穩穩定性。主要要表現在：（1）品種相相同、產地不不同的藥材化化學成分基本本相同，但含含量相差較大大；（2）菝葜與與其近緣品種種間的化學成成分及含量均均相差較大2.正品和近緣緣品種指紋圖圖譜的相似度差異較較大，表明研究和制定菝菝葜藥材的指指紋圖譜，對對控制其藥材材質量具有重重要意義。討論6.中藥指紋紋圖譜發展的的階段性中藥指紋圖譜譜的發展可分分為：初級階段高級階段：6.中藥指紋紋圖譜發展的的階段性（1）初級階階段確立指紋圖譜譜的建立方法法及相似度判判定。中藥注射劑起起效快，療效效好，化學成成分相對其他他中藥來說要要少得多，但但對其產品質質量要求又比比其他中藥制制劑更高，選選擇中藥注射射劑,開展展制訂其指紋紋圖譜工作具具有很強的可可行性。5.中藥指紋紋圖譜已取得得的成果（1）中藥質質量控制和評評價模式的轉轉變：開始由單一指指標成分的鑒鑒別及含量測測定為平臺向向以多組分相相互依存的化化學分布模式式的整體模式式——“指紋紋圖譜”模式式為平臺的遞遞進，即由““點”向“面面”遞進。5.中藥指紋紋圖譜已取得得的成果指紋圖譜在一一定程度上將將中藥的化學學成分以色譜譜整體為特征征展現出來，，先構建一個個“灰色質量信信息庫”，供我們逐步步揭示其化學學組成，以及及成分分布和和相互比例的的關系，逐步步減低其“灰灰度”，提高高“透明度””，讓我們看看的越來越清清楚，減少客客觀存在的不不確定性（模模糊性），提提高穩定性。。力求從整體體的視角把現現代科技研究究的與質量有有關的數據和和信息與中醫醫藥傳統經驗驗相結合。5.中藥指紋紋圖譜已取得得的成果（2）中藥指指紋圖譜實驗驗研究技術逐逐漸成熟：中藥指紋圖譜譜實驗研究技技術已有初步步的規范化要要求；指紋圖圖譜的實驗研研究與市場產產品的結合進進入了實用的的初級階段。。5.中藥指紋紋圖譜已取得得的成果（3）化學學計量學的滲滲透，迅速取取得初步成效效，并開發出出相應的計算算機軟件：a.相似度評評價法b.模糊聚類類分析法c.人工神經經網絡法d.主成分分分析法化學計量學在在指紋圖譜研研究和應用中中的結合逐漸漸向縱深發展展，促進化學學計量學迫切切地向“草根根問題”實用用研究發展。。5.中藥指紋紋圖譜已取得得的成果（4）74種種注冊中藥注注射劑指紋圖圖譜研究結合合生產實際取取得確鑿的成成果：不少品種通過過指紋圖譜的的研究，進一一步規范了生生產工藝、提提高了產品質質量，并通過過了技術鑒定定，如獲批準準為質量標準準的內容，將將對規范和監監管藥品的質質量穩定和一一致起到肯定定作用，對普普遍提升中藥藥產品質量起起到示范作用用。5.中中藥藥指指紋紋圖圖譜譜已已取取得得的的成成果果（5））指指紋紋圖圖譜譜技技術術得得到到全全國國范范圍圍的的普普及及，，有有關關高高等等院院校校及及科科研研機機構構普普遍遍列列入入科科研研選選題題，，論論文文數數量量飚飚升升，，促促進進了了色色譜譜技技術術的的迅迅速速提提高高。。5.中中藥藥指指紋紋圖圖譜譜已已取取得得的的成成果果（6））企企業業對對藥藥品品質質量量意意識識的的提提高高：：指紋紋圖圖譜譜技技術術不不僅僅已已應應用用于于中中藥藥注注射射劑劑的的質質量量控控制制，，而而且且也也促促使使某某些些企企業業意意識識到到藥藥品品市市場場由由商商業業運運作作取取勝勝必必將將逐逐漸漸轉轉向向以以內內在在質質量量取取勝勝，，由由行行政政保保護護逐逐漸漸轉轉變變為為依依靠靠自自身身技技術術提提高高保保護護，，而而開開始始自自覺覺和和主主動動地地對對自自己己的的主主要要產產品品進進行行指指紋紋圖圖譜譜研研究究。。6.中中藥藥指指紋紋圖圖譜譜發發展展的的階階段段性性存在在的的問問題題：：（1））指指紋紋圖圖譜譜的的研研究究集集中中在在藥藥材材，，對對復復方方的的研研究究不不多多如何何挖挖掘掘復復方方中中藥藥的的質質量量信信息息需需要要更更多多的的研研究究。。結結合合體體內內藥藥物物代代謝謝的的研研究究，，更更需需要要細細致致地地研研究究中中藥藥成成分分分分布布的的整整體體特特征征以以及及在在體體內內的的整整體體表表達達。。6.中藥藥指紋圖圖譜發展展的階段段性存在的問問題：（2）指指紋圖譜譜研究存存在由熱熱轉冷的的傾向：